WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах

На правах рукописи

Миняев Михаил Владимирович

Комплексное моделирование процесса измерения

биохимического потребления кислорода в жидких

инкубационных средах

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Тверь - 2007

Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук,

профессор Ворончихина Людмила Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

кандидат биологических наук, доцент Карцова София Владимировна

Ведущая организация Тверская государственная

медицинская академия

Защита состоится 12 ноября 2007 г. в 1400 на заседании диссертационного совета К 212.263.01 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 а, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170000, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.

Автореферат разослан «___» _____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Костюк Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Молекулярный кислород является без преувеличения важнейшим метаболитом аэробного обмена, имеющим ключевое значение в энергообеспечении организма. Поэтому уровень и характер биохимического потребления кислорода обычно рассматривается как основной показатель метаболической активности тканей, клеток и субклеточных структур. Современные биохимические измерительные приборы, предназначенные для регистрации данного показателя, обладают вполне приемлемыми техническими характеристиками. Тем не менее реальные результаты измерения биохимического потребления кислорода, согласно литературным данным, отличаются неоправданно низкой воспроизводимостью: ошибка среднего, которая в биохимических исследованиях используется для характеристики разброса показаний, при измерении метаболического потребления кислорода обычно составляет порядка 12% от измеряемой величины (Горская И.А., 1988; Капитанов А.Б. и др., 1990; Меерсон Ф.З., 1995 и др.), а довольно часто (Schurek H.J. et a., 1990; Ortmann C., 2003; Suttner S. et a., 2004 и др.) достигает 30 и более процентов. В результате корректной оказывается только сравнительная интерпретация полученных данных.

Подобное несоответствие между характеристиками оборудования и точностью полученных с его помощью результатов объясняется тем, что изменение концентрации кислорода в инкубационной среде, фиксируемое прибором, зависит не только от биохимического потребления кислорода изучаемым объектом, но и от диффузионных потоков кислорода между средой инкубации и ее окружением (Миняев М.В. и др., 1996, 2001, 2005, 2006, 2007), которые по величине сравнимы, а зачастую и превышают биохимическое потребление. Поэтому задача по выявлению и изучению факторов, определяющих величину и направление этих потоков, является актуальной, так как ее решение позволило бы существенно повысить точность биохимических исследований, связанных с изучением аэробного метаболизма и, как следствие, осуществить строгий количественный подход к изучению его важнейших биохимических механизмов.

Решение данной задачи с использованием аэробных биологических объектов оказалось крайне затруднительным по ряду причин, основной из которых явилась невозможность определения действительного количества потребленного ими кислорода и, следовательно, расчета наиболее важной количественной характеристики метода - относительной погрешности. Поэтому возникла необходимость моделирования биохимического процесса потребления кислорода с привлечением устойчивой, простой, доступной и воспроизводимой химической модели, так как действительное количество кислорода, поглощенное моделью, в отличие от биологического объекта, может быть легко проконтролировано. Использование подобной модели позволяет определять важнейшие динамические характеристики существующего оборудования, а также значительно облегчает разработку новой специальной биохимической аппаратуры, предназначенной для изучения аэробного метаболизма, что также является весьма актуальным.

Целью исследования явилось выявление и изучение факторов, искажающих результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами в малых объемах жидких инкубационных сред, и разработка специальной биохимической аппаратуры и методических подходов, позволяющих устранить или учесть влияние данных факторов для существенного повышения точности такого рода измерений.

В задачи исследования входило:

1) разработать эталонную химическую модель, имитирующую биохимическое потребление кислорода в жидких инкубационных средах, позволяющую точно контролировать действительное количество поглощенного кислорода;

2) путем химического моделирования метаболического потребления кислорода выявить факторы, оказывающие наибольшее искажающее влияние на результаты измерения потребления кислорода в малых объемах жидких инкубационных сред;

3) разработать конструкцию измерительной системы на базе амперометрического кислородного датчика, обладающую низкой собственной кислородной емкостью и позволяющую легко изменять и точно контролировать площадь поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации.





4) изучить динамику пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду открытой измерительной ячейки при различной площади поверхности раздела фаз воздух-среда;

5) разработать метод учета количества кислорода, поступившего в среду инкубации из атмосферы за время проведения замера биохимического потребления кислорода, и вычисления соответствующей поправки к результату измерения;

6) изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и собственной кислородной емкости измерительной системы в ходе замера потребления кислорода моделью биологического объекта;

7) разработать метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы и ее количественного вклада в погрешность измерения для вычисления соответствующей поправки к результату измерения биохимического потребления кислорода.

Научная новизна полученных данных. Впервые проведено исследование, в котором, путем моделирования биохимического потребления кислорода аэробным биологическим объектом, было изучено влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения потребления кислорода, полученные с помощью закрытого амперометрического кислородного датчика. На основании полученных данных разработана специальная биохимическая аппаратура и комплексный методический подход, позволяющие кардинально повысить точность подобных измерений и в значительной мере устранить искажения характера регистрационных кривых биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах.

Основные положения, выносимые на защиту. Неучтенный кислород, поступающий в среду инкубации из атмосферы, способствует существенному занижению результатов измерения биохимического потребления кислорода в открытых измерительных системах. Предлагаемый в данной работе метод позволяет учесть поступивший из атмосферы кислород и, таким образом, снизить погрешность измерения до уровня, характерного для закрытых измерительных систем.

Существующие приборы, предназначенные для измерения концентрации растворенного кислорода, обладают собственной кислородной емкостью. Диффузионный обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью измерительной системы ведет к заметному искажению результатов измерения биохимического потребления кислорода. Предлагаемый в данной работе метод предоставляет возможность определения как самой кислородной емкости, так и ее количественного вклада в величину погрешности результата измерения потребления кислорода, что позволяет существенно повысить точность такого рода измерений.

Конструкции выпускаемых промышленностью электрохимических измерительных приборов, предназначенных для регистрации метаболического потребления кислорода, не позволяют в достаточной мере учесть влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы на результаты измерения, чем обусловлена неоправданно высокая погрешность при их использовании в биохимических исследованиях. Предлагаемая в данной работе измерительная система дает возможность снизить погрешность динамического измерения биохимического потребления кислорода до уровня погрешностей используемого оборудования.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные вносят определенный вклад в экспериментальную биохимию аэробного метаболизма, позволяя с иной точки зрения взглянуть на интерпретацию результатов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность отдифференцировать биохимические и физико-химические причины регистрируемых изменений измеряемой величины при изучении потребления кислорода биологическими объектами. Большинство из выявленных в работе закономерностей являются универсальными, то есть в той или иной мере присущими любым измерительным системам, предназначенным для изучения биохимического потребления кислорода, вне зависимости от принципа их действия. Поэтому предлагаемый комплекс методических подходов может быть использован с любым биохимическим оборудованием подобного назначения, как существующим, так и перспективным.

Предложенный в работе подход к корректировке результатов измерения позволяет существенно повысить точность методов измерения биохимического потребления кислорода, что дает возможность обратиться к изучению тонких биохимических механизмов аэробного метаболизма, а также к исследованию биологических объектов, характеризующихся низким потреблением кислорода. Результаты исследования позволяют систематизировать подходы к выбору существующих и конструированию новых электрохимических датчиков и ячеек, предназначенных для биохимических и биоэнергетических исследований.

Разработанное оборудование, методы и полученные результаты используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре биомедицины Тверского государственного университета: в курсе лекций, большом практикуме, а также при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на научных конференциях студентов и аспирантов биологического факультета ТвГУ в 1995, 1998, 1999, 2000 и 2003 годах.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает: введение, 5 глав, заключение, выводы, список литературы. Работа изложена на 179 страницах, документирована таблицами (25) и иллюстрирована рисунками (37). Список литературы включает 114 отечественных и 84 зарубежные работы.

МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом настоящего исследования послужила измерительная система, состоящая из закрытого амперометрического кислородного датчика, открытой измерительной ячейки и вспомогательного оборудования, при помощи которой регистрировалось потребление кислорода моделью, имитирующей аэробный биологический объект. Выбор определялся широким распространением подобного рода измерительных систем в биохимических исследованиях и очевидным наличием у нее полного комплекса факторов, искажающих результаты измерения потребления кислорода.

Измерения проводились с использованием двух близких по параметрам кислородных датчиков: N5972 (промышленного изготовления; пр-во ПНР) и разработанного автором кислородного датчика с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ). Все замеры производились в десятикратной повторности (n=10) за исключением специально оговоренных случаев.





В качестве модели аэробного биологического объекта использовался ~0,01М свежеприготовленный раствор Na2SO3, концентрация которого перед каждым замером уточнялась титриметрически. Моделью среды инкубации служил водный раствор KCl (60 г/л), практически изотонический по отношению к электролиту датчика, что исключало искажение показаний, связанное с осмотическими явлениями на мембране.

Всего в ходе работы было записано и расшифровано 130 регистрационных кривых поглощения кислорода моделью аэробного биологического объекта, пассивного насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом и обмена кислородом между инкубационной средой и собственной кислородной емкостью измерительной системы. Проведено 240 контрольных титриметрических определений действительного количества поглощенного кислорода и 60 определений изменения концентрации раствора Na2SO3 под воздействием атмосферного кислорода.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первый этап работы, изложенный в главе 3, был посвящен выявлению факторов, оказывающих наибольшее искажающее воздействие на результаты измерения биохимического потребления кислорода биологическими объектами, а также разработке оборудования и модельных систем, позволяющих определить количественный вклад данных факторов в величину погрешности измерения.

На основании результатов измерения потребления кислорода модельным поглотителем в насыщенной атмосферным кислородом инкубационной среде, полученных при использовании измерительной системы на базе кислородного датчика N5972, было показано следующее.

1. Результаты измерений в исходно бескислородной системе (обработка измерительной ячейки раствором Na2SO3 и длительная продувка азотом), оказались воспроизводимо завышены на 18% по сравнению с действительными значениями (СV=8%), а в системе, насыщенной атмосферным кислородом - воспроизводимо занижены на 39% (СV=7%). Таким образом было показано, что в первом случае в системе присутствует неучтенный потребитель, а во втором - источник кислорода.

2. Результаты, полученные в бескислородной системе, как показано выше, в меньшей степени отличались от действительного значения, чем полученные в системе насыщенной кислородом. Таким образом, в обоих случаях измерение происходило на фоне притока кислорода извне.

3. При использовании воды в качестве среды инкубации чувствительность датчика в серии последовательных замеров прогрессивно снижалась: кривые становились более пологими, значение минимума повышалось, но после выдерживания датчика в течение нескольких часов в 5% растворе Na2SO3 его работоспособность полностью восстанавливалась.

4. При использовании в качестве среды инкубации изотонического по отношении к электролиту датчика раствора KCl, эффект «растягивания» кривых поглощения полностью устранялся, что сопровождалось снижением относительной погрешности измерения от -20,2 до -10% с одновременным возрастанием CV от 5 до 9%.

Таким образом, в результате предварительных экспериментов было установлено следующее:

- рассматриваемая измерительная система обладает собственной кислородной емкостью;

- атмосферный кислород во время регистрации потребления кислорода объектом диффундирует в инкубационную среду, что способствует занижению результата измерения;

- использование инкубационных сред, гипотонических по отношению к электролиту закрытого кислородного датчика, ведет к искажению характера кривых потребления и росту погрешности измерения.

На основании выявленных особенностей измерительной системы было предложено:

- в качестве исходного для проведения измерений использовать кислородный режим «100» (измерительная система предварительно насыщена кислородом путем длительной продувки атмосферным воздухом), как более стабильный и не требующий усилий для своего поддержания;

- в качестве модели инкубационной среды использовать водный раствор KCl (60 г/л), как не вызывающий искажения регистрационных кривых за счет осмотических эффектов на мембране кислородного датчика;

- отказаться от использования кислородного датчика N5972, как обладающего избыточно высокой собственной кислородной емкостью, величина которой существенно варьирует от замера к замеру, и разработать конструкцию амперометрического кислородного датчика, обладающего низкой и стабильной кислородной емкостью.

Разработанная автором конструкция кислородного датчика с пониженной кислородной емкостью (ПКЕ), представлена на рисунке 1 в одном масштабе с прототипом N5972. Снижение кислородной емкости датчика было осуществлено за счет уменьшения объема электролита, устранения из резервуара гидрофобных материалов и изменению способа крепления датчика к измерительной ячейке, в результате чего складки мембраны, удерживающие газовые пузырьки, были вынесены за пределы ячейки. Дополнительно была увеличена рабочая площадь мембраны, что существенно ускорило обмен кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью датчика.

Проверка работоспособности предложенной конструкции показала, что влияние кислородной емкости на результат измерения при использовании датчика ПКЕ стало несколько более выраженным (относительная погрешность увеличилась на 25%) и гораздо более воспроизводимым (CV снизился почти в 4 раза и составил 2,4%). Увеличение систематической ошибки, вносимой кислородной емкостью, на фоне снижения самой кислородной емкости, свидетельствует о том, что задача по увеличению скорости диффузии кислорода между инкубационной средой и емкостью была успешно решена. Об этом же свидетельствует и резкое улучшение воспроизводимости: благодаря высокой скорости диффузии исходное состояние емкости контролировалось гораздо надежнее.

Рис. 1. Особенности конструкции кислородных датчиков N5972 (а) и ПКЕ (б).

1 - катод; 2 - мембрана; 3 - резиновая манжета; 4 - складки мембраны; 5 - стенка измерительной ячейки; 6 - корпус (у датчика ПКЕ одновременно выполняет роль анода); 7 - электролит; 8 - анод.

Второй этап настоящего исследования (изложен в главе 4) был посвящен изучению динамики пассивной диффузии атмосферного кислорода в инкубационную среду открытой измерительной ячейки и разработке метода корректировки результата измерения на поступление кислорода из атмосферы в среду инкубации во время замера.

Для регистрации динамики насыщения измерительной системы атмосферным кислородом измерительную ячейку в исходном кислородном режиме «0» (кислород из системы предварительно удален путем обработки раствором Na2SO3, промывки и продувки азотом) заполняли 3,5 мл инкубационной среды, добавляли 100 мкл имитатора поглотителя (0,01М Na2SO4) и продували азотом до установления нулевых показаний регистратора. После этого продувку прекращали, закрывали ячейку плавающей перегородкой и производили непрерывную регистрацию изменения парциального давления кислорода в инкубационной среде, пока оно не достигало 70% (здесь и далее парциальное давление кислорода в среде выражается в процентах от парциального давления кислорода в атмосфере на момент измерения). Изменение площади контакта инкубационной среды с атмосферой осуществлялось путем размещения на поверхности инкубационной среды плавающих перегородок различного диаметра. Таким образом, в эксперименте использовались три типа ячеек: «открытая» - 183 мм2; «полузакрытая» - 89 мм2 и «закрытая» - 16 мм2.

Усредненные варианты кривых насыщения показаны на рисунке 2. Как видно из рисунка, скорость насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом проявляла отчетливую зависимость от площади поверхности раздела фаз.

Рис. 2. Регистрационные кривые насыщения инкубационной среды атмосферным кислородом в открытой (1), полузакрытой (2) и закрытой (3) ячейках (по средним значениям).

Для вычисления поправки к результату измерения потребления кислорода на его диффузию из атмосферы была предложена следующая методика: фрагмент каждой кривой насыщения (30-70%) разбивали на участки (P1; P2; …и т.д.), как показано на рис. 3, каждый из которых соответствовал 2%-ому изменению парциального давления кислорода в среде.

Рис. 3. Схема анализа примерной кривой насыщения.

Для каждого участка определяли время, необходимое для двухпроцентного изменения парциального давления кислорода в среде (t1; t2; …и т.д.). После чего средняя скорость насыщения среды кислородом (%/мин) для каждого из участков Pi рассчитывалась по формуле:

.

В дальнейших вычислениях значение средней скорости рассматривали как мгновенную скорость насыщения при парциальном давлении кислорода в среде. Мгновенную скорость диффузии кислорода в реакционную среду (моль/мин) рассчитывали по формуле:

,

где: a - цена 1% шкалы регистратора (моль/%), которая вычислялась как:

,

где: V - объем инкубационной среды с учетом объема добавки (мл); 2,156 ·10-7 - содержание кислорода в 1 мл дистиллированной воды (моль) при 370С и атмосферном давлении 760 мм рт.ст.; KC и KP - поправочные коэффициенты, которые вычислялись по формулам:

;,

где: C - концентрация солей в реакционной среде с учетом добавки (г/л); B - атмосферное давление в момент записи кривой насыщения (мм рт.ст.); 760 - нормальное атмосферное давление (мм рт.ст.).

Рис. 4. Зависимость скорости диффузии кислорода из атмосферы в среду инкубации от его парциального давления в среде для открытой (1), полузакрытой (2) и закрытой (3) измерительной ячейки.

Средние значения для открытой, полузакрытой и закрытой измерительных ячеек представлены на рис. 4. Как видно из рисунка, сокращение поверхности контакта ведет к заметному снижению скорости диффузии кислорода в среду, но, даже для закрытой ячейки, диффузия кислорода остается фактором, способным заметно влиять на точность измерения количества потребленного кислорода.

Данные, представленные на рис. 4 к сожалению нельзя рассматривать как калибровку измерительной системы из-за невозможности непосредственно откалибровать весь диапазон измерения (от 0 до 100%): во-первых, к моменту начала регистрации парциальное давление кислорода в среде успевает подняться до 5-10%; во-вторых, начиная с парциальных давлений 70-80% для закрытой ячейки наблюдается прогрессирующее искажение кривых насыщения, связанное с испарением воды из среды инкубации, предотвратить которое при температуре 370С в течение более 4 часов регистрации невозможно. Поэтому полученную зависимость преобразовывали в прямую пропорциональность, согласно закону диффузии Фика, с последующей аппроксимацией данных «неполной» калибровки на весь измеряемый диапазон. Для этого данные, представленные на рис. 4 отображали как зависимость скорости диффузии vдиф. от градиента парциальных давлений между атмосферой и средой (%), который вычисляли по формуле:

= 100 - ,

где: 100 - парциальное давление кислорода в атмосфере (%). Для аппроксимации использовались только участки кривых, характеризующиеся выраженной линейностью, на которых искажение сопутствующими факторами сказалось в наименьшей степени (31-61%).

Результаты аппроксимации несколько отклонились от закона диффузии (исходные линии тренда не прошли через начало координат), что на наш взгляд объясняется наличием у измерительной системы собственной кислородной емкости: скорости диффузии, рассчитанные по показаниям прибора, оказались пропорционально занижены из-за частичного оттока кислорода в исходно незаполненную кислородную емкость (для открытой ячейки занижение скоростей диффузии, по-видимому, маскируется за счет активного испарения воды с открытой поверхности инкубационной среды). Поэтому полученные линии тренда преобразовывались путем параллельного смещения до пересечения с началом координат, как показано на рис. 5. Уравнения преобразованных прямых, представленные на рисунке, использовались для вычисления скоростей диффузии кислорода в среду для всего диапазона измерений.

Рис. 5. Результат преобразования линий тренда.

Таким образом, в результате предварительной калибровки измерительной системы появилась возможность определить скорость диффузии кислорода в среду при любом парциальном давлении, что позволяет произвести корректировку результатов измерения потребления кислорода путем вычисления его количества, поступившего в среду на каждом из «двухпроцентных» участков корректируемой кривой поглощения.

Корректировке подвергались результаты трех серий по 10 замеров потребления кислорода модельным поглотителем. Замеры первой серии производились в открытой измерительной ячейке, второй - в полузакрытой и третьей - в закрытой.

Базовая составляющая количества кислорода, поглощенного в ходе каждого замера N0 вычислялась на основании минимального парциального давления кислорода в среде Pmin, соответствующего точке минимума кривой поглощения (рис. 6). Для этого производилась предварительная корректировка Pmin в связи с эффектом разбавления среды бескислородной добавкой по уравнению:

Рmin* = Рmin + ПР,

где: ПР - поправка на разбавление среды (%), вычисленная по формуле:

,

где: 100 - исходное парциальное давление кислорода в среде (%); VС - объем среды (мл); VД - объем поглотителя (мл).

После чего базовую составляющую количества поглощенного кислорода N0 вычисляли по формуле:

,

где: 100% - исходное парциальное давление кислорода в инкубационной среде; a - цена 1% шкалы регистратора (моль/%).

Рис. 6. Структура типичной кривой поглощения.

а - исходное парциальное давление кислорода в среде инкубации (100%); б - действительное снижение парциального давления кислорода, рассчитанное по результатам титрования поглотителя; в - минимальное парциальное давление кислорода в среде (Pmin); 1 - момент внесения поглотителя; 2 - нисходящая ветвь кривой поглощения; 3 - фрагмент восходящей ветви кривой.

Базовая составляющая N0 подвергалась дальнейшей корректировке для учета количества кислорода, поступившего в реакционную среду за время замера из атмосферы. Корректировка производилась путем вычисления поправки ПА, характеризующей диффузию кислорода из атмосферы, на основании характера нисходящей ветви кривой поглощения. Для этого нисходящую ветвь (рис. 6) также разбивали на участки (P1; P2; … и т.д.), каждый из которых соответствовал 2%-ому изменению парциального давления кислорода в среде. Затем определяли время, необходимое для 2%-го изменения парциального давления на каждом участке (t1; t2; … и т.д.).

Количество кислорода, поступившего в систему из атмосферы за каждый промежуток времени ti определяли по формуле:

,

где: - скорость диффузии кислорода (моль/мин) для участка Pi, рассчитанная на основании уравнений, представленных на рис. 2. Общую поправку на поступление кислорода из атмосферы ПА определяли как сумму всех индивидуальных поправок для каждого промежутка времени ti :.

Тогда исправленное количество кислорода NА, поглощенное сульфитом натрия с учетом поправки на поступление кислорода из атмосферы, вычисляли как сумму базовой составляющей N0 и поправки ПА:

.

Таблица 1. Зависимость результатов измерения поглощения кислорода 0,01М раствором Na2SO3 от площади контакта инкубационной среды с атмосферой (n=10).

SП мм2 NТ моль10-7 N0 моль10-7 ПА моль10-7 NА моль10-7
16 4,79±0,02 4,16±0,03 0,09±0,02 4,25±0,03
89 4,78±0,05 3,75±0,06 0,63±0,05 4,38±0,05
183 4,90±0,03 3,72±0,06 0,78±0,06 4,49±0,04

Результаты измерений и их последующей корректировки приведены в табл. 1, где: SП - площадь поверхности раздела фаз воздух - среда инкубации; NT - действительное значение измеренной величины, рассчитанное по результатам титрования поглотителя. Как видно из таблицы, увеличение площади контакта инкубационной среды с атмосферой ведет к заметному занижению результатов измерения. Использование поправки приводит к парадоксальному результату: точность измерения с увеличением площади контакта возрастает. Данная тенденция прослеживается и в изменениях значений относительной погрешности А(%), представленных в табл. 2. Несколько иначе изменяется коэффициент вариации Cv(%): его отчетливый рост для исходных значений при использовании поправки сменяется выравниванием, причем, характер изменения приобретает выраженное сходство с характером изменения коэффициента вариации действительных значений. Основной причиной выявленных фактов, как показано выше, также является собственная кислородная емкость измерительной системы.

Таблица 2. Влияние площади контакта инкубационной среды с атмосферой на погрешности измерения (n=10).

SП мм2 A (%) Cv (%)
Исходн. Исправл. Исходн. Исправл.
16 -13,20 -11,28 1,75 1,50
89 -21,56 -8,34 3,75 2,18
183 -24,11 -8,24 4,68 1,81

Таким образом, предлагаемый подход к корректировке результатов измерения потребления кислорода на взаимодействие среды инкубации с атмосферой позволяет заметно улучшить как точность, так и воспроизводимость, что дает возможность фиксации более тонких метаболических особенностей изучаемых объектов. В то же время эффективность подхода обнаруживает отчетливую зависимость от площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации, что объясняется наличием у измерительной системы собственной кислородной емкости, влияние которой наиболее отчетливо проявляется в закрытой системе (SП=16 мм2).

Третий этап исследования посвящен изучению влияния собственной кислородной емкости измерительной системы на точность измерения потребления кислорода (глава 4). Для этого оказалось необходимо: разработать метод измерения собственной кислородной емкости измерительной системы; изучить динамику обмена кислородом между средой инкубации и кислородной емкостью; разработать метод вычисления соответствующей поправки к результату измерения.

Метод определения собственной кислородной емкости измерительной системы, заключался в следующем. Измерительную ячейку (исходный кислородный режим «0»), заполненную инкубационной средой, продували азотом в течение 10 мин, после чего, не прекращая продувки, среду извлекали и продолжали пропускать азот через пустую измерительную ячейку еще в течение 5 мин. Затем включали регистратор, прекращали продувку, быстро заполняли ячейку 3,5 мл инкубационной среды, предварительно насыщенной кислородом воздуха при 370С, и закрывали ячейку плавающей полиэтиленовой перегородкой. В результате непрерывной регистрации получали кривую, отражающую процессы обмена кислородом между инкубационной средой и собственной кислородной емкостью системы (кривую обмена). Ход полученных кривых обмена с учетом латентности кислородного датчика (по средним значениям) представлен на рисунке 7.

Как видно из рисунка, кривая обмена имеет резкий перелом (на реальных кривых, показанных пунктиром, вместо точки перелома имеется выраженный максимум, соответствующий парциальному давлению кислорода Рmax): скорость снижения парциального давления кислорода в среде в первые 2 мин оказалась более чем на порядок выше, чем максимальная за последующие 60 мин регистрации. Поэтому было высказано предположение, что суммарная кислородная емкость измерительной системы состоит как минимум из двух независимых компонентов. Один из них характеризуется исключительно высокой скоростью обмена со средой инкубации и его реализация происходит в течение первых минут или даже секунд регистрации («быстрая» емкость). Второй компонент («медленная» емкость) гораздо менее доступен и характеризуется существенно более низкими скоростями обмена.

«Быстрая» кислородная емкость. Первоначально предполагалось, что практически вся кислородная емкость измерительной системы локализована внутри кислородного датчика и, таким образом, отделена от среды мембраной. Результаты эксперимента показали, что «быстрая» емкость физически не может располагаться за мембраной датчика, так как скорость обмена кислорода с «быстрой» емкостью заметно превышает скорость диффузии кислорода сквозь мембрану к измерительному электроду датчика. Таким образом, «быстрая» емкость могла быть локализована только в самой измерительной ячейке. В связи с тем, что при низкой полярности и достаточно шероховатой поверхности стенки сосуда, заполняющая его вода запирает в углублениях пузырьки воздуха (Адомсон У.А., 1979; Данкверст П.В., 1973), было высказано предположение, что «быстрая» кислородная емкость измерительной системы имеет именно такую, поверхностную, природу.

Рис. 7. Усредненная кривая обмена с учетом оттока кислорода в емкость в первые минуты измерения (в скобках даны точные координаты точки перегиба).

Определение величины «быстрой» кислородной емкости и вычисление поправки на ее влияние осуществлялось следующим образом: отклонение в показаниях датчика РS (%), обусловленное влиянием «быстрой» емкости рассчитывали как разность между исходным парциальным давлением кислорода в среде инкубации (100%) и значением максимума на кривой обмена Рmax (%):

РS = 100 - Рmax.

На основании отклонения рассчитывали количество кислорода nS (моль), перешедшее из среды в «быструю» емкость к моменту достижения точки максимума:

nS = РS · a,

где a - цена 1% шкалы регистратора (моль/%).

Так как скорость обмена с «быстрой» емкостью оказалась выше скорости реакции датчика, считали, что в момент достижения точки максимума исходно пустая «быстрая» емкость была заполнена кислородом на Рmax процентов. Таким образом, количество кислорода nS, перешедшее из среды инкубации в «быструю» емкость, составляло Рmax процентов от полной величины этой емкости. Поэтому полная величина «быстрой» емкости ЕS (моль) вычислялась по формуле:

.

Результаты обработки двадцати кривых обмена (n=20) приведены в таблице 3. Как видно из таблицы, среднее значение «быстрой» кислородной емкости составило 0,46·10-7 моля, что соответствует приблизительно 12% от содержания кислорода в среде. Несмотря на сравнительно небольшую величину, «быстрая» емкость способна оказывать существенное влияние на точность измерения даже при кратковременных замерах, так как характеризуется очень высокой скоростью обмена кислородом со средой.

Таблица 3. Результаты измерения «быстрой» кислородной емкости (n=20).

Показатель Рmax (%) РS (%) nS (моль·10-7) ES (моль·10-7)
92,21 7,79 0,43 0,46
m ±0,30 ±0,30 ±0,016 ±0,019
CV(%) 1,13 13,39 13,35 14,39

«Медленная» кислородная емкость для измерительной системы на базе кислородного датчика ПКЕ составила 2,7·10-7 моля. Метод ее определения, основанный на анализе нисходящих ветвей кривых обмена (рис. 7) подробно изложен в главе 5. Несмотря на то, что величина «медленной» емкости достигает 50% от содержания кислорода в 3,5 мл насыщенной модельной среды инкубации, ее влияние на точность кратковременных замеров потребления кислорода оказалось ничтожным из-за низкой скорости обмена кислородом между «медленной» емкостью и средой. По этой причине при корректировке результатов измерений, приведенных в данной работе, влияние «медленной» кислородной емкости не учитывалось. Тем не менее, при работе с реальными биологическими объектами, скорости потребления кислорода которыми зачастую оказываются существенно более низкими, «медленная» емкость вполне может оказаться в ряду основных факторов, искажающих результаты измерения.

Корректировка результатов измерения на влияние «быстрой» кислородной емкости. Корректировке подвергались результаты серии из 10 замеров потребления кислорода модельным поглотителем в закрытой измерительной ячейке. Корректировка затрагивала как действительное значение потребленного кислорода NT, вычисленное на основании результатов титрования поглотителя, так и результат измерения потребления кислорода NA (предварительно исправленный на поступление кислорода из атмосферы). Исправление действительного значения количества потребленного кислорода NT производили по формуле:

NT* = NT - ED,

где: NT* - исправленное количество потребленного кислорода, вычисленное по результатам титрования поглотителя (моль); ED - кислородная емкость наконечника микродозатора (моль). Далее при вычислении погрешности в качестве действительного значения использовалась величина NT*.

Для корректировки результатов измерения вычисляли долю кислородной емкости Pемк. (%), перешедшую в среду инкубации за время проведения замера, по формуле:

Pемк. = 100 - Pmin,

где: 100 - исходное парциальное давление кислорода в емкости (%); Pmin - парциальное давление кислорода в среде и в «быстрой» емкости (!) в момент достижения точки минимума на кривой поглощения (%). Тогда количество кислорода nS, перешедшее в среду, составляло Pемк. процентов от величины «быстрой» кислородной емкости ES. Поэтому поправку на влияние кислородной емкости ПS находили по формуле:

.

Исправленное значение поглощенного кислорода NA+E вычисляли как сумму количества поглощенного кислорода с учетом влияния атмосферного воздуха NA и поправки на кислородную емкость ПS:

NA+E = NA + ПS

Ход и результаты корректировки представлены в таблице 4.

Таблица 4. Комплексная корректировка результатов измерения потребления кислорода на влияние атмосферного кислорода и собственной кислородной емкости измерительной системы (n=10).

Показатель NT* (моль10-7) NА (моль10-7) Pемк. (%) ПS (моль10-7) NA+E (моль10-7)
4,63 4,26 82,6 0,38 4,64
m ±0,015 ±0,028 ±0,61 ±0,0031 ±0,031
А(%) - -10,90 - - 0,19
CV(%) 0,98 2,00 2,23 2,48 2,02

Как видно из таблицы, относительная погрешность измерения при использовании поправки на собственную кислородную емкость измерительной системы снизилась по модулю с 10,9 до 0,19%, то есть в 57 раз при практически неизменном значении коэффициента вариации (СV = 2,00 и 2,02% соответственно). Таким образом, разработанный автором комплекс поправок позволил свести систематическую составляющую погрешности при кратковременных измерениях потребления кислорода практически к нулю при достаточно высокой воспроизводимости результатов.

ВЫВОДЫ

1. Разработана воспроизводимая (CV1%) химическая модель, имитирующая биохимическое потребление кислорода аэробным биологическим объектом, с использованием сульфита натрия в качестве поглотителя, пригодная для динамической калибровки измерительных систем и определения их основных технических характеристик.

2. Факторами, в наибольшей степени искажающими результаты измерения биохимического потребления кислорода при использовании открытых измерительных систем, являются диффузионные обменные потоки кислорода между средой инкубации и атмосферой, а также между средой инкубации и собственной кислородной емкостью измерительной системы.

3. Разработана измерительная система, предназначенная для изучения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах, обладающая низкой и стабильной собственной кислородной емкостью (ES=0,46·10-7 моля, EL2,7·10-7 моля), предоставляющая возможность оперативного изменения площади поверхности раздела фаз воздух-среда инкубации от 183 до 16 мм2.

4. Динамика пассивной диффузии кислорода из атмосферы в инкубационную среду незначительно отклоняется от закона диффузии для неоднородных сред под влиянием собственной кислородной емкости измерительной системы и за счет испарение воды с поверхности раздела фаз.

5. Учет количества кислорода, поступившего из атмосферы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -24,11 до -8,24% для открытой измерительной ячейки.

6. Собственная кислородная емкость измерительной системы, построенной на базе закрытого амперометрического кислородного датчика, включает не менее двух компонентов («быструю» и «медленную» емкость), характеризующихся различными скоростями обмена кислородом со средой.

7. Учет количества кислорода, перешедшего из «быстрой» кислородной емкости измерительной системы в среду инкубации во время замера, позволяет снизить относительную погрешность измерения биохимического потребления кислорода с -10,90 до 0,19% для закрытой измерительной ячейки.

8. Использование комплекса методических подходов, учитывающих обмен кислородом между средой инкубации и ее окружением, и оригинальных измерительных средств позволяет снизить относительную погрешность измерения потребления кислорода с -38,63 до 0,19%, а коэффициент вариации измеренных значений - с 8,91 до 2,02%.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миняев М.В. Применение гальванического кислородного датчика в стандартном исполнении для регистрации потребления кислорода в малых объемах воды и водных растворов / М.В. Миняев, Г.А. Грибанов, И.И. Гугушвили // Учен. зап. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 1996. - Т.3. - С. 56-58.

2. Миняев М.В. Метод использования сульфита натрия для проверки и калибровки кислородных датчиков / М.В. Миняев, Н.Е. Дронникова // Пути оптимизации функции дыхания при нагрузках, в патологии и в экстремальных состояниях: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 1999. - С. 72-77.

3. Миняев М.В. Гальванический кислородный датчик с пониженной собственной кислородной емкостью / М.В. Миняев // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 2001. - С. 154-161.

4. Миняев М.В. Собственная кислородная емкость закрытых кислородных датчиков / М.В. Миняев, И.И. Гугушвили // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 2001. - С. 161-166.

5. Миняев М.В. Метод коррекции результатов измерения поглощения кислорода в сообщающихся с атмосферой измерительных ячейках / М.В. Миняев, Г.А. Грибанов, И.И. Гугушвили // Актуальные проблемы биохимии и биотехнологии: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 2001. - С. 166-174.

6. Миняев М.В. Усовершенствованный метод коррекции результатов измерения потребления кислорода в сообщающихся с атмосферой измерительных ячейках / М.В. Миняев, Ю.А. Кабанова, Н.В. Сладкова // Пути оптимизации функции дыхания при нагрузках, патологии и экстремальных воздействиях: сб. науч. тр. / Тверской гос. ун-т. - Тверь. - 2005. - С. 25-32.

7. Миняев М.В. Влияние толщины полиэтиленовой мембраны на работу полярографического кислородного датчика закрытого типа / М.В. Миняев, Н.О. Иванова // Вестник ТвГУ: биология и экология. - 2005. -Т.10. - №4. С. 84-87.

8. Особенности использования микродозаторов с полиэтиленовыми наконечниками для калибровки кислородных датчиков / М.В. Миняев, М.Д. Платонова, К.В. Костина, Л.И. Ворончихина // Вестник ТвГУ: биология и экология. - 2006. -Т.22 - №5. С. 53-56.

9. Разбавление среды инкубации бескислородной добавкой как вероятная причина «эффекта быстрого потребления кислорода» / М.Б. Белякова, М.В. Миняев, А.А. Егорова, Л.И. Ворончихина // Вестник ТвГУ: биология и экология. - 2006. -Т.22 - №5. С. 57-60.



 


Похожие работы:

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«Артамонов Александр Юрьевич ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины...»

«ЛАТКИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА РАСПРОСТРАНЕНИЕ ОТОДЕКТОЗА СОБАК И КОШЕК В СУРГУТСКОМ РАЙОНЕ ХАНТЫ-МАНСИЙСКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА И ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭТОЙ ИНВАЗИИ 03.00.19 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии и в условиях клиники Сургутской...»

«Шрамко Павел Александрович РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ОБОЛЕНСК-2012 Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки Государственный...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«ПЕСТОВ АРТУР ЮРЬЕВИЧ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БИОЦЕНОЗА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ КАРИЕСЕ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ Авторефераты Январь-2013 1. Аббасова, Самира Фуад кызы. Возможности видеоэндоскопического хирургического лечения хронического калькулезного холецистита у лиц пожилого возраста : автореферат диссертации. кандидата медицинских наук : 14.01.17 / С. Ф. Аббасова ; Российский университет дружбы народов (М.), кафедра госпитальной хирургии. - М. : б. и., 2013. - 19 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1). 2.

«Блохина Светлана Викторовна ЭПИЗО ОТО ЛОГИЯ ЦИСТНО ГО ЭХИНОКОККОЗ А В ОМСКОЙ О Б ЛАСТИ 03.00.19 - паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень - 2009 Работа выполнялась в ФГУ ВПО Омский государственный аграрный университет и в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО...»

«МИХАЙЛОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА БИОЛОГИЯ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских...»

«УДК 579.22.577.121 ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном...»

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«Шамова Ольга Валерьевна Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения...»

«ШАРПАН Мария Владимировна МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРЯ 03.00.16 – Экология (физико-математические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук К раснодар 200 8 Работа выполнена на кафедре прикладной математики ГОУ ВПО К убанский государственный...»

«Павлов Виталий Михайлович Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis 03.02.03– микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. НАУЧНЫЙ...»

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«Жадченко Юлия Викторовна Распространенность стафилококков в популяции лиц, живущих в крупном промышленном городе 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор...»

«Суфияров Ринат Сабитович КОМПЛЕКСНАЯ ПРОФИЛАКТИКА, ДИАГНОСТИКА И ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННЫХ ГНОЙНО- ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 14.01.17. – ХИРУРГИЯ 03.02.03- микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук УФА – 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального...»







Загрузка...



 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.