WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Pages:   || 2 |

Разработка и применение биологических моделей для изучения хронической туберкулезной инфекции

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Потапов Василий Дмитриевич

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Оболенск – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

доктор ветеринарных наук, профессор Светоч Эдуард Арсеньевич


Официальные оппоненты:


Афанасьев Станислав Степанович – заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н. Габричевского» Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии


Дядищев Николай Романович – доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное учреждение науки «Научно–исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов» ФМБА, директор


Черноусова Лариса Николаевна – доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза» РАМН, заведующая отделом микробиологии

Ведущая организация:

Московское бюджетное учреждение здравоохранения «Московский городской научно-практический центр борьбы с туберкулезом»

Защита диссертации состоится «20» декабря 2013 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФБУН ГНЦ ПМБ) Роспотребнадзора

Автореферат разослан «_____» ____________ 2013 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Туберкулез (ТБ) относится к числу инфекционных заболеваний, которые наносят значительный ущерб здоровью населения многих стран мира, поражая представителей всех рас и национальностей. В России в последние десятилетия отмечают рост заболеваемости туберкулезом: 34,0 случая на 100 тыс. населения в 1991 г., 90,7 в 2000 г., 56,4  в 2010 г. (WHO, 2011). Появляются новые нозологические формы и органные локализации туберкулезной инфекции: туберкулез селезенки (Azzam, 2013), поджелудочной железы (Vafa et al., 2013), центральной нервной системы (Delance et al., 2013), глаз (Yeh et al., 2012), спинальный туберкулез (Yuan et al., 2013). Все чаще регистрируется хроническое и латентное течение болезни (Druszczynska et al., 2012; Moon, Hur, 2013). Эти факты ученые связывают со способностью Mycobacterium tuberculosis переходить в дормантное (покоящееся) состояние (Kumar et al., 2013; Mariotti et al., 2013), которое позволяет микобактериям при определенных условиях реактивироваться в вегетативную форму (Gupta, Srivastava, 2012) и вызывать обострение хронической или латентной форм туберкулезной инфекции. Обострение болезни зачастую приводит к утяжелению течения болезни и увеличению летальности среди больных (Silva et al., 2010). В качестве факторов, активирующих туберкулез, могут выступать хронический стресс, голодание, прием иммуносупрессоров, а также наличие у пациента заболеваний, снижающих естественный иммунный статус (ВИЧ-инфекция, системные гематологические патологии, онкологические болезни) (Wake et al., 2013; Al-Anazi et al., 2007; Baka et al., 2013).

Показано, что активация хронического или латентного туберкулеза коррелирует со значительным изменением состава мембранных, цитоплазматических и секретируемых белков у реактивированных дормантных форм возбудителя болезни (Mylliemngap et al., 2012, Gupta, Srivastava, 2012). Особая роль при этом отводится мембранным белкам Rрf (resuscitation promoting factors), ответственным за «оживление» дормантных клеток M. tuberculosis (Капрельянц и др., 2004). В литературе описаны также случаи активации туберкулезного процесса у онкологических больных и у больных СПИДом, вакцинированных штаммом M. bovis BCG, в результате перехода клеток этого штамма из дормантного в вегетативное состояние (Bustamante et al., 2007; Lukacs et al., 2013; de Souza Campos Fernandes, Medina-Acosta, 2010). Подобные наблюдения дают основания некоторым исследователям ставить под вопрос безопасность дальнейшего использования вакцины BCG для профилактики туберкулеза (Mitchell, Scott, 1992). Тем не менее, вакцина BCG, представляющая собой аттенуированный штамм M. bovis, и сейчас продолжает оставаться единственной живой противотуберкулезной вакциной, способной обеспечить защиту вакцинированных детей от диссеминированного (милиарного) туберкулеза. Однако этот препарат не защищает взрослых людей от легочного ТБ, который на сегодняшний день является самой эпидемически опасной формой заболевания. Осложнения после применения вакцины BCG, которые, по классификации Международного союза по борьбе с туберкулезом ВОЗ (WHO, 1984) принято называть БЦЖ-инфекцией или «БЦЖитом» (BCGdisease, BCGitis) (Rook et al., 2001).





В настоящее время многие исследовательские группы в разных странах работают над созданием новых живых и химических противотуберкулезных вакцин на основе рекомбинантных штаммов и секретируемых белков возбудителя (Beresford, 2010; Dillon, 2000; Mori, 2004; Olsen, 2001; Roche, 1996). Особую актуальность приобретает разработка новых лечебных противотуберкулезных препаратов, воздействующих губительно не только на возбудителя инфекции, но и стимулирующих защитные свойства макроорганизма (Бельский и др., 2009).

Разработка и испытание новых противотуберкулезных лекарственных и профилактических средств для человека, как правило, предполагает предварительное тестирование этих препаратов на биологических моделях: in vitro – на искусственно культивируемых клетках и тканях теплокровных животных, и in vivo – на мелких и крупных животных разных видов.

Важная информация о развитии туберкулезного процесса была получена на культурах макрофагов и нейтрофиллов в 70-е гг. прошлого столетия и в последующие годы (Muroaka, Takeya, 1976; Nomoto et al., 1976; Brown et al., 1983; Nathan, Hibbs, 1991; Morris et al., 2013). В частности, выявлено, что в ответ на присутствие микобактерий фагоциты генерируют активные, с бактерицидными свойствами формы кислорода и NO*-радикалы, существенно влияющие на тяжесть течения болезни. Установлено, что именно высокий уровень естественного синтеза NO* в фагоцитах мышей обеспечивает данному виду животных более высокую, по сравнению с морскими свинками, устойчивость к заболеванию туберкулезом (Блум, 2002). Врачебные подходы, основанные на стимуляции системы «окислительного взрыва» фагоцитов с помощью новых противотуберкулезных лекарственных и профилактических средств, открывают новые возможности клиницистам позитивно влиять на течение инфекционный процесса у больного (Shiloh et al., 1999; Пальцев, 2004).

Животные модели ТБ-инфекции используют для воспроизведения различных форм ТБ инфекции, изучения патоморфологических изменений органов и тканей в инфицированном организме, для тестирования эффективности новых вакцин и методов лечения туберкулеза, выяснения причин неудач клинической терапии и других целей (Smith et al., 1989; vanMiert et al., 1995; Каркищенко, 2004; Apt et al., 2011). При этом для решения конкретных задач используют разные виды и линии животных, а также варьируют способы их заражения (Барри, 2002). Весьма сложной задачей в области применения животных моделей для воспроизведения туберкулезной инфекции является моделирование хронической и латентной форм туберкулеза (предмет наших исследований). По мнению Apt et al. (2011), наиболее приемлемым для моделирования хронического и латентного туберкулеза является низкодозовое аэрозольное инфицирование животных. Однако использование данной модели ТБ инфекции ограничивается высокой стоимостью оборудования (аэрозольных установок) и сложностью обеспечения безопасности экспериментов. Кроме того, к недостаткам аэрозольного инфицирования можно отнести значительные колебания «разброса» в заражающих дозах, получаемых отдельными особями одной экспериментальной партии.

Поэтому поиск животной модели для воспроизведения хронического и латентного туберкулеза представляется весьма актуальной задачей для исседователей этого опасного для человека заболевания.


Цель исследования

Целью настоящего исследования является разработка новой мышиной модели хронического туберкулеза и ее использование для изучения патогенеза указанной формы болезни, поиска и оценки новых противотуберкулезных препаратов профилактического и терапевтического назначения, а также использование других видов животных и моделей для исследования туберкулезной инфекции.


Задачи исследования:

1. Разработать новую, удобную для исследователей, модель хронического туберкулеза на мышах линии C57Bl и сравнить ее с другими моделями туберкулезной инфекции.

2. На разработанной мышиной модели изучить реактивацию хронической туберкулезной инфекции при воздействии на организм больных животных иммуномодуляторами: липополисахаридом Escherichia coli, аминогуанидином, анти-ФНО моноклональными антителами.

3. Изучить на разработанной мышиной модели хронического туберкулеза реактивацию инфекции, вызванной мутантными вариантами штамма M. tuberculosis H37Rv, нокаутными по генам секретируемых белков rpf (resuscitation promoting factors), под воздействием перечисленных выше иммуномодуляторов.

4. На мышиной «аэрозольной» модели туберкулезной инфекции изучить вирулентные свойства мутантных вариантов штамма M. tuberculosis H37Rv, нокаутных по двум-четырем генам rpf.

5. На мышиных «аэрозольной» и «внутривенной» моделях туберкулезной инфекции оценить протективные свойства нокаутного штамма M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD как возможного кандидата для создания противотуберкулезной вакцины.

6. На «внутривенной» мышиной модели и на «аэрозольной» модели морских свинок провести испытание экспериментальных образцов новых субъединичных кандидатных противотуберкулезных вакцин «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD», являющихся комплексными субстанциями, включающими в себя антигены микобактерий Ag85 и ESAT-6, «слитые» с декстран-связывающим доменом DBD, в смеси с адъювантом (декстран 500), по схеме «prime-boost».

7. На клеточной модели «окислительного взрыва» фагоцитов изучить эффективность препаратов липосомированных эфирных масел растений (ЛЭМР) как стимуляторов данного биологического феномена.

8. На моделях хронического туберкулеза у мышей и острого туберкулеза у морских свинок провести испытание спреевых форм липосомированных растительных эфирных масел как профилактических и терапевтических средств.

9. Оценить эффективность применения препарата липосомированных эфирных масел раститений, изученных на биологических моделях, в качестве профилактического и терапевтического противотуберкулезного средства в лечебно-профилактических учреждениях Московского региона.

Научная новизна

Впервые, с помощью разработанной мышиной модели хронической туберкулезной инфекции, подтверждена роль секретируемых белков Rpf в реактивации хронического туберкулеза в острый инфекционный процесс. Показано, что хронический туберкулез, формирующийся у мышей линии C57Bl после их заражения микобактериями внутрибрюшинно, по сравнению с другими биологическими моделями туберкулезной инфекции (хроническая и острая ТБ инфекция у мышей после аэрозольного заражения, острая инфекция ТБ у мышей после ретроорбитального заражения), характеризуется более постоянными показателями обсемененности паренхиматозных органов M. tuberculosis H37Rv (разброс показателей КОЕ патогена в легочной ткани разных животных в группе не превышает 20 – 30 %) и минимальным уровнем летальности инфицированных мышей (около 10 % животных за 18 мес.)

Впервые экспериментально показано, что нокаутные по двум-четырем генам rpf штаммы M. tuberculosis H37Rv в разной степени способны к реактивации в организме модельных мышей линии C57Bl, подвергнутых воздействию липополисахарида E. coli, аминогуанидина и анти-ФНО моноклональных антител: наибольшая активация зафиксирована у «двойных» мутантов, в меньшей степени – у «тройных» и полностью отсутствует у «четверных» мутантов.

Впервые на мышиной «аэрозольной» модели показана разная степень аттенуации «двойных», «тройных» и «четверных» нокаутных мутантов по генам rpf штамма М. tuberculosis H37Rv. Максимально аттенуация выражена у «четверного» мутанта M. tuberculosis H37RvrpfA rpfB rpfC rpfD.

Впервые показано, что нокаутный мутантный штамм M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD, утративший вирулентность и неактивирующийся в макроорганизме при иммуносупрессии, способен обеспечивать лабораторным животным защиту от заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv и может быть рекомендован в качестве кандидатного штамма для создания живой противотуберкулезной вакцины.

Впервые показана эффективность новых субъединичных кандидатных противотуберкулезных вакцин нового поколения «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD», при их применении на втором этапе вакцинации (после иммунизации BCG) по схеме «prime-boost».

Впервые на моделях первичных культур нейтрофилов и макрофагов показан феномен активации «окислительного взрыва» фагоцитов липосомированными эфирными маслами растений; продемонстрирован лечебный противотуберкулезный эффект при аэрозольной обработке ЛЭМР мышей, больных хроническим туберкулезом и профилактический противотуберкулезный эффект спреевых форм ЛЭМР в экспериментах на морских свинках. Впервые получены данные об эффективном использовании ЛЭМР при аэрозольной обработке воздуха в лечебно-профилактических учреждениях Москвы и Московской области, основанные на анализе показателей микробной чистоты воздуха, а также клинических показателей больных туберкулезом пациентов (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля и др.).

Теоретическая и практическая значимость работы

Создана новая биологическая модель для изучения ТБ хроническая туберкулезная инфекция у мышей, развивающаяся у них после внутрибрюшинного заражения клетками штамма M. tuberculosis H37Rv. Эта модель позволяет изучать особенности патогенеза хронического и латентного туберкулеза, механизмы активации инфекции под воздействием различных неблагоприятных факторов, а также проводить испытания новых кандидатных вакцинных штаммов. Разработаны и внедрены на учрежденческом уровне методические рекомендации: «Использование модели внутрибрюшинного заражения мышей для получения хронической туберкулезной инфекции», Оболенск, 2010 г., и «Порядок работы с аэрозолями наночастиц и микроорганизмов (с использованием установки Глас-Кол модели 099С А4224)», Оболенск, 2010 г.

Два штамма M. tuberculosis H37Rv, мутантные по генам rpf, rpfA rpfB rpfC rpfD и rpfA rpfB rpfC rpfЕ, обеспечивающие защиту мышей от туберкулезной инфекции, предложены в качестве кандидатов для создания живой противотуберкулезной вакцины нового поколения. Штаммы депонированы в коллекции «ГКПМ-Оболенск» (№ B-6857 и В-6857) (Федеральный уровень внедрения).

Получен патент РФ «Композиция из взвеси липосом для профилактики и лечения воздушно-капельных инфекций, в частности туберкулеза (варианты) и способ ее аэрогенной доставки» №2452470 (Федеральный уровень внедрения).

Результаты исследования использованы при разработке Методических указаний МУ 1.2. 2635-10. «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов» – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010 г. (Федеральный уровень внедрения); Санитарных правил «Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности (опасности). Изменения и дополнения 1 к СП1.3.1285-03» М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения ЛЭМР применяются в практической работе лечебных учреждений Московского региона.

Данные экспериментальных исследований диссертационной работы используются в курсах лекций по магистерской образовательной программе «Нанобиобезопасность» Пущинского государственного естественно-научного института (ПущГЕНИ) и по программе Курсов повышения квалификации «Микробиология. Основы и особенности работы с биологическими агентами I-IV групп патогенности в научно-исследовательских лабораториях», «Химическая, биологическая и бактериологическая безопасность. Основы безопасной работы на биотехнологических и микробиологических производствах», «Инфекционные болезни. Основы биологической безопасности и практика работ с микроорганизмами I-IV групп патогенности».

Методология и методы исследования

Эксперименты, представленные в диссертационной работе, выполнены на основе комплексного использования методов микробиологии (микроскопии, культивирования микроорганизмов), иммунологии (иммуноферментного анализа, проточной цитофлуориметрии), биохимии (определение уровня лимфокинов в крови, электрофорез), биофизики (спектрофотометрия, хемолюминесценция, спектральный анализ), молекулярной генетики (полимеразная цепная реакция), биотехнологии (технология липосом), медицины (анализ клинических показателей состояния больных туберкулезом), математической статистики (статистическая обработка данных).

Положения, выносимые на защиту:

  1. Разработанная in vivo-модель хронического туберкулеза, основанная на внутрибрюшинном заражении лабораторных мышей линии C57Bl клетками штамма M. tuberculosis H37Rv, позволяет изучать факторы, активирующие указанную форму болезни, оценивать возможность реактивации кандидатных вакцинных штаммов микобактерий, а также тестировать новые противотуберкулезные лекарственные препараты.
  2. Способность нокаутных мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv к реактивации в организме модельных животных в результате воздействия на последних иммуномодуляторами, а также уровнь аттенуации этих мутантов коррелируют с количеством инактивированных у них генов секретируемых белков Rpf, участвующих в реактивации дормантных форм туберкулезного микроба.
  3. Аттенуированный, не способный реактивироваться в организме теплокровного животного под воздействинем иммуносупрессоров штамм M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD, обладает протективными свойствамии и может быть рекомендован в качестве кандидатного штамма для создания живой противотуберкулезной вакцины.
  4. Вакцинация мышей по схеме «prime-boost», включающая в себя первичную иммунизацию («prime») живой противотуберкулезной вакциной BCG и последующие ревакцинации («boost») субъединичными противотуберкулезными вакцинами нового поколения, созданными на основе антигенных туберкулезных комплексов Ag85 и ESAT-6 и адъюванта декстрана 500, обеспечивает высокий уровень защиты экспериментальных животных от заражения туберкулезом на моделях морских свинок и мышей.
  5. Липосомированные растительные эфирные масла при аэрозольном использовании обладают лечебным противотуберкулезным эффектом на модели хронического туберкулеза у мышей, а также профилактическим противотуберкулезным эффектом на модели острого туберкулеза у морских свинок.
  6. Аэрозольная обработка помещений лечебно-профилактических учреждений препаратами липосомированных растительных эфирных масел обеспечивает улучшение показателей микробной чистоты воздуха, а также клинических показателей у туберкулезных больных (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля и др.).

Степень достоверности и апробация результатов

Материалы диссертации представлены на 13 Всероссийских и международных научных конф.х: IV международной конф. «НаноБио и другие новые и перспективные технологии», Пущино, 2007 г.; «Проблемы биобезопасности нанотехнологий», Москва, 2008 г.; Научно-практической конф. молодых ученых и специалистов научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире», Оболенск, 2009 г.; 13ой Международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2009 г.; Международной конф. «Современные проблемы инфекционной патологии», Минск, 2009 г.; Московской международной научно-практической конф. «Биотехнология: экология крупных городов», Москва, 2010 г.; 14-ой Международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2010 г.; 3-м Международном Форуме по нанотехнологиям, Москва, 2010 г.; VII Всероссийской научно-практической конф. «Молекулярная диагностика-2010», Москва, 2010 г.; III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2011 г.; 15-ой международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2011 г.; 12ом Международном форуме и выставке «Высокие технологии XXI века», Москва, 2011 г.; 51-th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2011 г.; Всероссийской молодежной конф. «Актуальные проблемы химии и биологии», Пущино, 2012 г.; 17-ой международной Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2013 г.

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторном научном семинаре ФБУН ГНЦ ПМБ «16» сентября 2013 г., протокол №____






Личный вклад в выполнение работы

Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах, получены в сотрудничестве с коллегами: лаборатории биологически активных наноструктур Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, зав. лабораторией д.б.н В.Г. Лунин; лаборатории электронной микроскопии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. лабораторией д.б.н В.Н. Герасимов; отдела иммунобиохимии ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.б.н. С.Ф. Бикетов; лаборатории биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, зав. лабораторией д.б.н., профессор А.С. Капрельянц; отдела особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ, зав. отделом к.м.н. А.Н. Мокриевич; ООО «РЕБИОН», научный консультант д.б.н. С.А. Чубатова.


Публикации

По теме диссертации опубликовано 46 научных работ, в том числе 10 статей в рецензируемых изданиях, один патент, два методических документа Федерального уровня, три статьи в других изданиях и 30 тезисов сообщений на научных конференциях.


Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 250 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, пять глав собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 100 отечественных и 160 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 7 таблицами и 49 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ


В литературном обзоре представлены современные данные по биологии M. tuberculosis – возбудителя туберкулеза у человека, взгляды на механизмы патогенеза возбудителя туберкулеза у человека и животных, а также проведен сравнительный анализ разработанных на настоящий момент биологических моделей, предлагаемых для изучения данного инфекционного заболевания.


СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ


Микроорганизмы. Штаммы М. bovis BCG Russia (B4824) и M. tuberculosis H37Rv АТСС 25618 (B4825) получены из коллекции ГКПМ-Оболенск. Мутантные варианты штамма M. tuberculosis H37Rv, несущие делеции 2-5 генов rpf, любезно предоставлены нам Dr. Mazrahi из лаборатории молекулярной микобактериологии Национального Центра Здравоохранения ЮАР. MDR штаммы. tuberculosis PS-09RifR IzoR EtaR и M. tuberculosis mR01 RifR IzoR EtaR StrR KanR AmiR KapR, получены из Супранациональной лаборатории ВОЗ (Швеция). Культуры микобактерий выращивали на плотной питательной среде Middelbrook 7H11 AgarBase (HiMedia, Индия) и жидкой питательной среде 7Н9 (HiMedia, Индия).

Лабораторные животные. Самки мышей линии Balb/С и C57Bl в возрасте 7-8 недель, с массой тела 20-22 г. предоставлены питомником ФБУН ГНЦ ПМБ. Эксперименты проводили в соответствии со стандартными требованиями (Лившиц, 1978).

Клеточные линии. Линия макрофагоподобных клеток мыши J774 и линия эпителиальных клеток матки человека HeLaS3 получены из Российской Коллекции Клеточных культур «РККК» (Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург); мышиные перитонеальные макрофаги и нейтрофилы, а также нейтрофилы периферической крови человека выделяли in situ в ходе выполнения данной работы.

Моделирование ТБ инфекции у мышей осуществляли путем внутривенного, внутрибрюшинного или аэрогенного введения 0,1 мл суспензии клеток штамма М. tuberculosis H37Rv на животное. Эксперименты по аэрозольному заражению животных проводили на установке CO 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США).

Моделирование ТБ инфекции у морских свинок выполняли с помощью аэрозольного заражения бактериями штамма M. tuberculosis H37Rv в концентрации 106 КОЕ/животное в камере CO 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США).

Определение количества колониеобразующих единиц (КОЕ) М. tuberculosis H37Rv в органах зараженных животных проводили высевом гомогенатов органов методом 10кратных разведений в забуференном физрастворе (ЗФР), содержащем 0,05 % Твин–80, на плотную питательную среду Middelbrook 7Н11 (Himedia, Индия), содержащую 20 % сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Специфичность выросших колоний подтверждали с помощью окрашивания бактерий по Цилю-Нильсону, световой микроскопии и полимеразной цепной реакции (ПЦР) со специфичными праймерами на последовательность инсерционного элемента IS6110.

ПЦР-детекцию возбудителя туберкулеза осуществляли с помощью амплификации на приборе Терцик (ДНК-технология, Россия), используя для этого специфичные праймеры IS6 – GGCTGTGGGTAGCAGACC и IS7 – CGGGTCCAGATGGCTTGC для последовательности инсерционного элемента IS6110 размером 163 п. о. ДНК M. tuberculosis (Desjardin, 1998). В качестве матрицы брали образцы препаратов ДНК, выделенной из гомогенатов органов животных. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле.

В экспериментах по иммуносупрессии на мышах использовали: препараты моноклональных анти-ФНО антител, любезно предоставленные нам к.б.н. Аббасовой С.Г., группа иммунохимии Филиала института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Пущино; антитела вводили животным внутрибрюшинно по 0,2 мл в течение 10 дней; препараты ЛПС E. coli, любезно предоставленные нам к.б.н. Шайхутдиновой Р.З., лаборатория микробиологии чумы ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск, вводили животным в брюшную полость однократно, по 1,5 мкг/животное; препараты аминогуанидина (Fluka, Германия) инъецировали животным внутрижелудочно через зонд в виде водного раствора по 125 мкг/животное в сутки в течение 10 дней или однократно внутрибрюшинно по 125 мкг/животное.

Патоморфологические исследования срезов тканей проводили, используя световую и электронную микроскопию. Световую микроскопию образцов тканей животных, окрашенных гематоксилин-эозином после обезвоживания и парафинирования и заключенных в бальзам, выполняли на микроскопе NikonEclipse 80,. оснащенном цифровой камерой NikonDS-U2 (Япония). Электронную микроскопию ультратонких срезов бактерий и макрофагов, подготовленных по методу (Ryter A et.al., 1958), изучали и фотографировали в электронном микроскопе Н-500 (Хитачи, Япония), при ускоряющем напряжении 75 кВ и увеличении в 3000-50000 раз, изображения оценивали согласно рекомендациям (Автандилов и др., 1984).

Определение клеточнгого состава поверхности слизистых оболочек носа пациентов проводили с помощью окрашивания мазков по Гимза-Романовскому (Лабинская А.С.,1978).

Изучение иммунного ответа на туберкулезные антигены и противотуберкулезные вакцины на мышиной модели проводили с помощью:

- реакции бласттрансформации лимфоцитов: Т-лимфоциты, полученные из суспензии гомогената селезенки мышей, обрабатывали ультразвуковым лизатом клеток BCG в концентрации 108 КОЕ/мл или рекомбинантными антигенами Ag85В-(His)6 и ESAT-6-(His)6 в концентрации 2 мкг/мл. Митоген конканавалин А (Sigma) в концентрации 5 мкг/мл использовали в качестве положительного контроля. Уровень пролиферации лимфоцитов оценивали по интенсивности митохондриального дыхания (Mosmann,1983);

- уровень синтеза интерферона лимфоцитами мышей оценивали в супернатанте спленоцитов, культивируемых со специфическими туберкулезными антигенами и конканавалином А, иммуноферментным методом с использованием наборов «INF-gamma 96» (BenderMedSystems, Германия);

- определение количества ФНО в сыворотке крови мышей проводили на приборе Victor X3 2030 (PerkinElmer, Сингапур) с использованием набора Mouse TNF- Platinum ELISA (Bioscience, США), в соответствии с рекомендациями производителя;

- исследование гуморального иммунитета у мышей проводили на 15 сутки после второй иммунизации. У 3 мышей из каждой группы проводили отбор крови для получения сыворотки и постановки ИФА для определения уровня антител к ультразвуковому лизату BCG и рекомбинантным белкам Ag85А, ESAT-6 и CFP-10 в сыворотках иммунных животных.

Оценку жизнеспособности эукариотических клеток проводили с помощью:

- АТФ-метрии - по концентрации АТФ в культуре клеток, определяемой по уровню биолюминесценции с помощью коммерческого набора ApoGlow (Promega, США), в соответствии с инструкцией производителя;

- метода МТТ - колориметрического теста, основанного на способности дегидрогеназ митохондрий живых клеток восстанавливать желтый МТТ (3-(4,5-диметитиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) до синего формазана (Friedlander, 1986). Измерение оптической плотности растворов проводили при длине волны 595 нм на многоканальном спектрофотометре Victor X3 2030 (PerkinElmer, Сингапур).

Оценку функциональной активности фагоцитарных клеток осуществляли методом хемилюминесценции (ХЛ) в 96-луночных планшетах для сцинтилляционного счета, в которые вносили суспензию фагоцитов так, чтобы конечная концентрация составляла 0,5  106 кл/мл., затем добавляли суспензию зимозана в концентрации 2 мг/мл по 0,02 мл в лунку и 5,6  10-4 М раствор люминола по 0,02 мл в лунку. Детекцию хемилюминесценции проводили на приборе Victor X3 2030 (PerkinElmer, Сингапур) при температуре 37 °С с интервалами 10 с, как сумму импульсов за 120 мин.

Оценку функциональной активности фагоцитов осуществляли по фагоцитарному индексу (ФИ), индексу завершённости фагоцитоза (ИЗФ) и методом бактериальных высевов. Для исследования фагоцитоза в суточную монослойную культуру макрофагов вносили бактериальную взвесь в ЗФР из расчета 100 кл./макрофаг. После 8 ч инкубации при температуре 37 °С в атмосфере с 5 % СО2 проводили оценку ФИ путем визуального просмотра монослоя под микроскопом и подсчета суммы поглощенных частиц, общего количества макрофагов и количества фагоцитировавших макрофагов.

Испытание экспериментальных образцов вакцин осуществляли при подкожной иммунизации, вводя 0,1 мл/животное в трех опытных группах мышей по 16 особей, трехкратно, с перерывом между вакцинациями 15 дней. Для оценки протективного действия рекомбинантных антигенов их иммобилизовали на полисахаридном носителе – декстране с 1,25% содержанием CpG олигонуклеотидов – лигандов Толл-подобных рецепторов 9. Вакцинацию лабораторных животных проводили по схеме гомологичной «prime-boost» иммунизации. Для этого животным подкожно с двухнедельным интервалом вводили препарат рекомбинантных антигенов в смеси с адъювантом (вакцины «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD»). В качестве препарата сравнения использовали вакцину BCG в качестве моновакцины, а также при совместном использовании с вакцинами «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD» (гетерологичная «prime-boost» иммунизация).

Липосомированные эфирные масла растений (ЛЭМР) производства ООО «Ребион» (патенты РФ № 2311449, 2393905 и 2394419), содержащие эфирные масла монарды дудчатой (Monarda fistulesa), бархатцев мелкоцветковых (Tagetes patula L.), экстракт из сосны обыкновенной (Pinus silvestris) и липофолк, из которого сформированы липосомы, а также вспомогательные компоненты-гелеобразователи (глицерин, карбокси-этил-целлюлозу, бланозу и карбопол), натрия гидроксид (стабилизатор рН) и эпофен (антиоксидант).

Бактерицидные свойства ЛЭМР в отношении возбудителя туберкулеза оценивали in vitro (CDC, 1998). В качестве тест-штаммов использовали лабораторный штамм М. tuberculosis H37Rv, а также множественно-устойчивые к антибактериальным препаратам (MDR) штаммы М. tuberculosis PS-09 RifR IzoR EtaR и M. tuberculosis mR01 RifR IzoR EtaR StrR KanR AmiR KapR, полученные из Супранациональной лаборатории ВОЗ (Швеция).

Изучение действия ЛЭМР на модели хронического туберкулеза у мышей линии C57Bl проводили в аэрозольной камере CO 099С А4224 (GLAS-COL APPARATUS, США), с контролированным дозированием препаратов. Лечение препаратами ЛЭМР проводили один раз в сутки, по 15 мин, в течение 7 дней. Расчетная концентрация аэрозоля составляла 10-4 мг/л, при этом каждое животное получало дозу ~210-6 мкг.

Обработку помещений лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) препаратами ЛЭМР проводили один раз в сутки с помощью распыления механическим дозатором, направляя струю вверх под углом в 50-60  от горизонтальной поверхности. Расход препарата на комнату площадью 20–30 м2 составлял 910 мл.

Методы статистической обработки. Количественные показатели экспериментов подвергали статистической обработке с помощью критерия Стьюдента и непараметрического рангового критерия Мана-Уитни. Различия между опытной и контрольной группами признавали достоверными при P<0,05. Расчеты проводили с помощью пакета программ Windows Excell.


Глава 3. РАЗРАБОТКА ВНУТРИБРЮШИННОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОГО ТУБЕРКУЛЕЗА НА МЫШАХ ЛИНИИ C57BL


Моделирование хронического туберкулеза на лабораторных животных представляется весьма важным и необходимым звеном в изучении физиологии и патогенеза инфекционного процесса при этой форме болезни, перехода ее в острую форму, а также для поиска эффективных лечебных препаратов и схем их применения. На первом этапе разработки модели мы провели исследования по разработке способа подготовки клеточных суспензий M. tuberculosis, которая позволила преодолеть высокую агрегированность (клампированность) клеток при культивировании M. tuberculosis на искусственных питательных средах и обеспечила максимальную жизнеспособность обрабатываемых клеток. На следующем этапе решалась задача выбора линии мышей для воспроизведения модели, заражающих доз возбудителя туберкулеза и способов инфицирования животных, вызывающих у них хроническую (а не острую) туберкулезную инфекцию, с наименьшим статистическим разбросом микробиологических показателей процесса у животных одной опытной группы.

Способ подготовки суспензии микобактерий для заражения животных был разработан с учетом того, что патогенные свойства возбудителя туберкулеза зависят от условий выращивания, хранения и степени дезагрегации суспензий культуры для заражения. Выбор оптимального способа приготовления заражающей суспензии возбудителя сделан на основе экспериментальной проверки качества дезагрегации клеток культуры, выполненной с помощью ультразвука и суспендирования инсулиновым шприцем. Учитывая эффективность дезагрегации клеток туберкулезного микроба и их поврежденности при использовании двух указанных методов подготовки культуры, оцененные с помощью оптической и электронной микроскопии и высевов на плотные питательные среды, для дальнейшей работы был выбран метод суспендирования с помощью инсулинового шприца.

Выбор линии мышей для моделирования хронического туберкулеза был осуществлен после определения динамики количества микобактерий в органах мышей двух линий после инфицирования их клетками М. tuberculosis H37Rv. В опытах была зафиксирована разница этого показателя для животных линий C57Bl и BalbC (рис. 1), а также разница в проявлениях клинических симптомов болезни у них.

Для дальнейших работ по воспроизведению модели хронического туберкулеза была выбрана линия мышей C57Bl, поскольку мыши этой линии более чувствительны к заражению (заражающая доза ~105 КОЕ/животное), чем мыши линии BalbC (заражающая доза ~106 КОЕ/животное).

Рисунок 1 - Динамика изменения содержания микобактерий в легких мышей линий C57Bl и BalbC при хроническом течении туберкулезного процесса, вызванного заражением животных внутрибрюшинно клетками М. tuberculosis H37Rv в дозах 105 КОЕ/животное и 106 КОЕ/животное, соответственно

Существенным преимуществом линии C57Bl по сравнению с линией BalbC является то, что у мышей этой линии стабилизация уровня обсемененности микобактериями легких происходит относительно быстрее и держится на стабильно низком уровне (~103 – 104 КОЕ/орган).

Зависимость эффективности формирования хронического туберкулезного процесса у мышей от способа и дозы заражения изучали, используя три способа введения микобактерий подопытным мышам линии C57Bl: внутривенного, аэрозольного и внутрибрюшинного. В ходе работы установлено, что внутрибрюшинный способ заражения лабораторных животных клетками вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv обладает существенным преимуществом по сравнению с традиционно используемыми для воспроизведения хронического туберкулеза у животных (Smith, et al, 1989) аэрогенным или внутривенным способами заражения: при внутрибрюшинном введении клеток М. tuberculosis мышам происходит более медленная их диссеминация по внутренним органам по сравнению с диссеминацией патогена при аэрозольном или внутривенном введении (рис. 2А, 2Б).

Для выбора оптимальной дозы заражения мышей для воспроизведения хронического туберкулезного процесса у животных были проведены эксперименты по определению вирулентности клеток штамма M. tuberculosis H37Rv для животных при разных способах их инфицирования (рис. 3).

Рисунок 2 – Динамика КОЕ M. tuberculosis H37Rv в паренхиматозных органах мышей линии C57Bl на различных сроках после инфицирования внутрибрюшинным (А) и внутривенным (Б) способами

Рисунок 3 – Выживаемость (А) мышей линии C57Bl через 90 дней после внутрибрюшинного, внутривенного и аэрозольного заражения разными дозами клеток штамма M. tuberculosis H37Rv и результаты высевов микобактерий из гомогенатов легких выживших мышей (Б)

Установлено, что оптимальной дозой клеток штамма М. tuberculosis H37Rv при внутрибрюшинном способе заражения мышей линии C57Bl, не вызывающей большой гибели животных и позволяющей надежно фиксировать микробиологическими методами факт заболевания туберкулезом, является доза 105 КОЕ/животное.

Патоморфология хронического туберкулеза у мышей линии C57Bl, зараженных внутрибрюшинно клетками штамма М. tuberculosis H37Rv не отличается от таковой, описанной при других способах заражения животных клетками возбудителя туберкулеза. На 30-й день после заражения клетками штамма М. tuberculosis H37Rv у мышей отмечают значительные изменения во внутренних органах: селезенка и печень увеличены, наполнены кровью; легкие имеют более бледный вид, чем в норме, с узелковыми поражениями.

Морфологическая структура селезенки изменена: белая пульпа занимает довольно большую площадь, плотно инфильтрирована лимфоцитами, с очаговыми скоплениями ретикулярных клеток; красная пульпа многоклеточная, с преобладанием лимфоцитов, а также большим количеством плазматических клеток и гипертрофированных макрофагов (рис. 4А). В паховых лимфатических узлах имеет место выраженная лимфоцитарная инфильтрация, с плотными скоплениями лимфоцитов в отдельных синусах; плазматическими клетками занята относительно небольшая часть мозговой зоны (рис. 4Б). В печени отмечаются множество гранулем, разной величины, состоящих из лимфоцитов и гистиоцитов (рис. 4 В).

Рисунок 4 - Гистологические срезы органов мышей линии C57Bl на 90-й день после внутрибрюшинного заражения клетками штамма M. tuberculosis H37Rv в дозе 105КОЕ/животное: А - селезенка (х40), Б - лимфатический узел (х20), В – печень (х20)

Динамика фагоцитоза и переживания микобактерий в фагоцитах представлена на рис. 5, из которого следует, что максимальный уровень обсемененности перитонеальных макрофагов микобактериями отмечается через 24 ч после заражения животных, к 96 ч он становится минимальным.

Бактерицидные свойства макрофагов перитонеального эксудата оценивали по изменению активности продукции кислородных радикалов (супероксида) макрофагами в зависимости от дозы заражения (рис. 6А) и в зависимости от времени после заражения животных (рис. 6Б). Продукция супероксида перитонеальными макрофагами резко снижается (в 10 раз) через 24 ч, а затем медленно возвращается к нормальному уровню.

Рисунок 5 - Количество клеток M. tuberculosis H37Rv в перитонеальных макрофагах мышей после внутрибрюшинного инфицирования (А); изменение числа фагоцитировавших перитонеальных макрофагов после внутрибрюшинного инфицирования M. tuberculosis H37Rv (Б)


Рисунок 6 – Продукция супероксида клетками перитониального эксудата в зависимости от дозы внутрибрюшинного заражения (А); и от времени, прошедшего после заражения мышей клетками M. tuberculosis H37Rv (Б)


Исследование морфологии фагоцитированных микобактерий показало, что при заражении микобактериями штамма M. tuberculosis H37Rv клеток J774.1А in vitro и перетонеальных макрофагов in vivo происходит изменение размеров и формы микобактерий. По данным электронной микроскопии, морфологические изменения клеток M. tuberculosis наиболее ярко выражены в условиях пребывания их в перитонеальных макрофагах in vivo. После 48 ч пребывания в организме животного бациллярная форма микобактерий с соотношением осей 6,5:1 постепенно изменяется на овоидную с соотношением осей 1,5:1 (табл. 1). При более продолжительных сроках пребывания микобактерий в макрофагах как перетонеального эксудата, так и культуры J774.1А, отмечается увеличение количества микроформ микобактерий, что является, по всей вероятности, критерием физиологической адаптации микроорганизма к внутренней среде фагоцита (рис. 7).

Таблица 1 – Изменение средних размеров клеток M. tuberculosis H37Rv в фагоцитах перитонеального эксудата in vivo

в зависимости от времени фагоцитоза

Рисунок 7 – Электронно-микроскопическая фотография клеток M. tuberculosis H37Rv, выращенных на питательной среде 7H9, увеличение 1:1000 (А) и после персистенции в течение 72 ч в перитонеальных макрофагах, увеличение 1:5000 (Б)

Таким образом, внутрибрюшинное заражение мышей линии С57Вl клетками штамма M. tuberculosis H37Rv в дозе 105 КОЕ/животное позволяет воспроизвести у животных, через 3-4 месяца после их инфицирования, хроническую форму туберкулеза, характеризующуюся низкой обсемененностью органов микобактериями в течение длительного времени (до 18 мес.). Это происходит, по-видимому, вследствие установления динамического равновесия между размножением клеток M. tuberculosis и их инактивацией иммунной системой макроорганизма.


Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВАЦИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ НА РАЗРАБОТАННОЙ МЫШИНОЙ МОДЕЛИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ОРГАНИЗМ БОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ


Изучение воздействия липополисахарида E. coli и аминогуанидина на бактерицидные свойства макрофагов в экспериментах in vitro


На рис. 8 представлены результаты изучения влияния иммунотропных веществ на персистенцию клеток M. tuberculosis H37Rv в макрофагоподобных клетках J774. Полученные данные свидетельствуют, что липополисахарид E. coli в концентрации 0,1 мг/л, по всей вероятности, стимулирует антимикробную активность макрофагов и тем самым снижает сроки персистирования возбудителя туберкулеза в них. В концентрациях 0,5–10 мг/л ЛПС, напротив, увеличивает продолжительность пребывания клеток M. tuberculosis в макрофагоподобных клетках линии J774, то есть в указанных количествах ЛПС снижает физиологическую активность макрофагов.

Добавление к макрофагам аминогуанидина в концентрациях 5-300 мг/л снижало их бактерицидную активность и соответственно увеличивало сроки персистирование клеток возбудителя в макрофагах.

Таким образом, в опытах in vitro были получны данные о возможности с помощью определенных количеств ЛПС и аминогуанидина стимулировать размножение клеток M. tuberculosis в макрофагах. Эти результаты явидись основанием для использования препаратов ЛПС и аминогуанидина в последующих экспериментах по изучению хронического туберкулеза у мышей.

Рисунок 8 – Персистенция клеток M. tuberculosis H37Rv в культуре J774 в зависимости от концентрации: ЛПС (А); аминогуанидина (Б)

Использование разработанной мышиной модели для изучения реактивации хронической туберкулезной инфекции in vivo

Разработанная нами модель хронического туберкулеза с успехом использована для изучения активации туберкулезной инфекции под воздействием иммуномодулирующих препаратов: аминогуанидина, ЛПС и моноклональных антител анти-ФНО (рис. 9).

Аминогуанидин после 10-дневного выпаивания его мышам, больным хроническим туберкулезом, вызывал у животных активацию туберкулезного процесса: количество клеток M. tuberculosis H37Rv в тканях легких уже через месяц после начала введения препарата возрастало не менее, чем на порядок. Увеличение числа клеток возбудителя в легких продолжалось на протяжении 60 дней после начала введения аминогуанидина. Затем количество микобактерий в легких постепенно снижалось, однако уровень обсемененности в них по-прежнему был выше уровня, который отмечался у животных до обработки их аминогуанидином (рис 9А).

Рисунок 9 - Изменение количества микобактерий в легких мышей, больных хроническим туберкулезом, вызванным штаммом M. tuberculosis H37Rv, под влиянием аминогуанидина, вводимого перрорально в дозе 125 мкг/животное в сутки в течение 10 дней (А); моноклональных анти-ФНО антител – вводимых внутрибрюшинно в дозе 500мкг/животное в течение 10 дней (Б); ЛПС E. coli 5 мкг на животное в физрастворе, внутрибрюшинно (В)

Моноклональные антитела анти-ФНО, блокируя провоспалительный цитокин ФНО, приводят к нарушению всего цитокинового каскада и разрушению гранулем в тканях больных туберкулезом животных и человека (Algood H. M., et al. 2005). Как показали наши исследования, однократное внутрибрюшинное введение анти-ФНО антител мышам, больным хроническим туберкулезом, вызывает у них к 30 дню после введения увеличение количества микобактерий в легких. В последующие дни количество клеток патогена снижается, и к 90-му дню после введения анти-ФНО антител число микобактерий в легких достигало первоначального уровня (до обработки препаратом) (рис. 9Б).

Липополисахарид E. сoli, введенный однократно в дозе 5 мкг мышам, больным хроническим туберкулезом, также вызывал у них обострение инфекционного процесса: на 10-й день после обработки препаратом в легких животных резко увеличивалось число клеток M. tuberculosis (рис. 9В).

Таким образом, разработанная нами мышиная модель хронического туберкулеза вполне пригодна для изучения процесса активации хронического туберкулеза под влиянием определенной группы веществ, обладающих угнетающим действием на иммунную систему теплокровных.

Глава 5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗРАБОТАННОЙ МЫШИНОЙ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОГО ТУБЕРКУЛЕЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕАКТИВАЦИИ МУТАНТНЫХ ВАРИАНТОВ ШТАММА M. TUBERCULOSIS H37RV ПО ГЕНАМ RPF


Изучение биологических свойств нокаутных по генам rpf мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv на мышиных «аэрозольной» и «внутбрюшинной» моделях туберкулезной инфекции

Важным свойством любой живой вакцины является показатель остаточной вирулентности ее аттенуированного штамма, его способность вызывать патогенетические реакции в макроорганизме. Остаточная вирулентность присуща всем вариантам вакцинного штамма BCG и служит одной из важных его характеристик. В случае ее отсутствия вакцинный штамм не смог бы приживаться в организме хозяина и индуцировать формирование иммунного ответа. Вирулентные свойства штамма M. tuberculosis H37Rv и его мутантных по генам rpf производных мы оценивали на мышах линии C57Bl при аэрозольном и внутрибрюшинном их заражении высокими дозами патогена 5106 клеток/особь этих культур микобактерий. Было показано, что делеционные варианты обладают пониженной вирулентностью по сравнению с таковой исходного родительского штамма М. tuberculosis H37Rv. Мутанты с четырьмя делециями генов rpf были не вирулентными для мышей линии C57bl (рис. 10).

Рисунок 10 - Выживаемость мышей после внутрибрюшинного (А) и аэрозольного (Б) заражения мышей линии C57Bl клетками мутантных штаммов М. tuberculosis H37Rv, несущих «двойные» АВ, АС и «тройные» АВС, АСD делеции генов rpf; «четверные» мутанты не представлены ввиду отсутствия гибели животных в данных группах

При этом обсемененость органов животных клетками мутантных вариантов, по сравнению с таковой у исходного штамма М. tuberculosis H37Rv была значительно ниже.. По показателю КОЕ при одинаковых дозах заражения наименьшие результаты обсемененности органов у инфицированных животных были получены для мутанта, несущего делеции четырех генов rpf (рис. 11).

Рисунок 11 - Сравнительная обсемененность легких мышей при туберкулезной инфекции, вызванной лабораторным штаммом M. tuberculosis H37Rv и «четверными» нокаутными мутантами по генам rpf (ABCD и ACDE), доза заражения - 1,3104 КОЕ/мышь

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что мы имеем набор мутантов штамма M. tuberculosis H37Rv, различающихся между собой уровнем остаточной вирулентности для мышей линии C57Bl. У этих мутантов в последующих экспериментах были изучены протективные свойства.


Способность хронической туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными мутантами штамма M. tuberculosis H37Rv, к активации под воздействием аминогуанидина, липополисахарида E. coli и анти-ФНО моноклональных антител

Изучение нокаутных мутантов по генам rpf штамма M. tuberculosis H37Rv представляет большой интерес для разработки подходов к созданию противотуберкулезных живых вакцин на основе аттенуированных штаммов, обладающих важным для них свойством: не реактивироваться и не вызывать патологический процесс в организме вакцинированного в случае возможной его иммуносупрессии. Как было показано в наших исследованиях (Biketov et al., 2005), белки Rpf играют важную роль в процессах перехода дормантных форм возбудителя туберкулеза в активно размножающиеся вегетативные клетки. Данные белки вызывают структурную модификацию поверхности клетки за счет своей лизоцимоподобной активности.

Проведенные нами эксперименты по активации хронической туберкулезной инфекции, вызванной нокаутными по генам rpf мутантами штамма M. tuberculosis H37Rv, показали, что инфекция, обусловленная исходным материнским штаммом H37Rv, и мутантным вариантом с двумя дефектными rpf генами, могут быть активированы путем обработки мышей препаратами, снижающими иммунитет у животных: аминогуанидином, ЛПС и анти-ФНО антителами. Активация туберкулезного процесса выражается в существенном увеличении количества клеток M. tuberculosis в легочной ткани животных. Напротив, активировать хронический туберкулез, вызванный у мышей мутантами, имеющими делеции трех или четырех генов rpf, применяя иммуносупрессанты, не удается (рис. 1215).

Неспособность трех- и четверных мутантов реактивироваться в ослабленном иммуносупрессантами организме мышей явилась предпосылкой для постановки нами экспериментов по изучению у них протективных свойств.

Рисунок 12 - Активация аминогуанидином хронического туберкулезного процесса, вызванного штамом M. tuberculosis H37Rv ABC (А) и M. tuberculosis H37Rv ACD (Б), доза заражения 3,6103 КОЕ/мышь

Рисунок 13 - Активация аминогуанидином хронического туберкулезного процесса, вызванного штамами M. tuberculosis H37Rv ABCD (А) и M. tuberculosis H37Rv ACDE (Б) в дозе заражения 4,6104 КОЕ/мышь

Рисунок 14 – Влияние анти-ФНО моноклональных антител на показатель КОЕ в легких мышей для животных, больных хроническим туберкулезом, вызванным мутантами штаммами M. tuberculosis H37Rv ABCD (А) и M. tuberculosis H37Rv ACDE (Б) в дозе заражения 4,6104 КОЕ/мышь

Рисунок 15 – Влияние ЛПС E. coli на показатель КОЕ в легких мышей, больных хроническим туберкулезом, вызванным мутантными штаммами M. tuberculosis H37Rv ABCD (А) и M. tuberculosis H37Rv ACDE (Б) в дозе заражения 4,6104 КОЕ/мышь

Оценка протективных свойств нокаутных мутантов по генам rpf штамма M. tuberculosis H37Rv на мышиных «аэрозольной» и «внутривенной» моделях туберкулезной инфекции


Способность обеспечивать защиту мышей линии C57Bl от туберкулезной инфекции, вызванной штаммом M. tuberculosis H37Rv, оценивали у нокаутного по четырем генам rpf мутанта, поскольку именно этот штамм, как это следует из вышеизложенного материала, был неспособен реактивироваться, то есть переводить обусловленный им хронический туберкулезный процесс в острый при обработке организма мышей иммунодепрессантами.

Показано, что иммунизация мышей линии C57Bl клетками штамма M. tuberculosis H37Rv ABCD приводила к защите животных от внутривенного заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. Уровень протективного эффекта, опосредованный этим штаммом, был аналогичным данному показателю для вакцинного штамма BCG: в обоих случаях к 120-му дню эксперимента все неиммунизированные животные погибли, в то время как около 50 % вакцинированных животных выжило (рис. 16А). Наличие протективного эффекта при иммунизации животных «четверным» по генам rpf мутантом M. tuberculosis H37Rv ABCD потверждено результатами высевов клеток вирулентного штамма после заражения иммунизированных животных (рис. 16Б).

Рисунок 16 – Динамика гибели мышей в эксперименте по оценке степени защиты от острой туберкулезной инфекции при иммунизации животных штаммами M. tuberculosis H37Rv ABCD и BCG (А). Изменение количества клеток вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv в легких мышей, предварительно иммунизированных штаммом M. tuberculosis H37Rv ABCD, в сравнении с таковым при иммунизации BCG (Б). Контроль – неиммунизированные мыши

Таким образом, штамм M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD может быть предложен в качестве кандидата для создания живой противотуберкулезной вакцины нового поколения: он обладает протективным эффектом, в значительной степени аттенуирован и не способен активироваться в организме теплокровного животного при воздействии иммуносупрессоров: ЛПС E. coli, аминогуанидина и анти-ФНО моноклональных антител.



Глава 6. ИСПЫТАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ НОВЫХ СУБЪЕДИНИЧНЫХ КАНДИДАТНЫХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНЫХ ВАКЦИН НА МОДЕЛЯХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ


Изучение способности адъювантов вызывать реактивацию хронического туберкулеза у мышей

Созданная нами мышиная модель хронического туберкулеза, основанная на внутрибрюшинном заражении животных, использована для оптимизации компонентного состава субъединичных противотуберкулезных вакцин, разрабатываемых лабораторией биологически активных наноструктур Государственного учреждения «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» РАМН.

Генноинженерные субъединичные вакцины нового поколения «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD» являются комплексной субстанцией, включающей в себя антигены микобактерий, «слитые» с декстрансвязывающим доменом DBD, в смеси с адъювантом. Нами было проведено сравнительное изучение нескольких видов адъювантов по их способности вызывать обострение хронической туберкулезной инфекции. Показано, что уровень реактивации микобактерий при использовании декстрана 500 в качестве активирующего агента был незначительным (рис. 17).

Рисунок 17 - Изменение количества клеток вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv в легких мышей через 30 суток после введения адъювантов внутрибрюшинно по 0,5 мг/животное: 1 – полный адъювант Фрейнда; 2 – неполный адъювант Фрейнда; 3 – декстран 100; 4 – декстран 500; 5 – 1,3 -глюкан (зимозан); 6 – контроль (физраствор)

Генноинженерные белки Ag85A и ESAT6, иммобилизованные на полисахаридной матрице декстрана 500, при иммунизации животных обеспечивали, за счет постепенного выхода антигенов из белково-полисахаридного комплекса в результате естественной диссоциации, высокую иммуногенность препарата.


Изучение эффективности применения противотуберкулезных субъединичных вакцин нового поколения «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD» по схеме иммунизации «prime-boost» на мышиной модели

Проведено сравнительное изучение эффективности субъединичных вакцин и вакцины BCG при использовании разных схем иммунизации мышей линии C57Bl. Протективные свойства вакцин оценивали на модели острого туберкулеза у мышей, вызываемого путем ретроорбитального заражения животных штаммом М. tuberculosis H37Rv, и у морских свинок, вызываемого путем аэрозольного заражения животных тем же штаммом. Для каждой группы мышей через 30 и 60 суток после их заражения определяли обсемененность легких и селезенки вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv.

Показано, что однократная вакцинация тестируемыми кандидатными вакцинными препаратами предотвращала развитие туберкулезной инфекции у животных и увеличивала процент выживаемости животных после ретроорбитального заражения клетками штамма М. tuberculosis H37Rv в группе вакцинированных животных, по сравнению с группой невакцинированных животных (рис. 18).

Рисунок 18 – Гибель мышей линии С57Bl после заражения клетками вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv в дозе 106 КОЕ/мышь: 1 иммунизация вакциной BCG (n = 8); 2 – трехэтапная иммунизация вакцинами BCG, Ag85A и Ag85A (n = 8); 3 – однократная иммунизация смесью вакцин Ag85A и ESAT6 (n = 8); 4 неиммунизированных (n = 8)

Экспериментальные данные показывают также, что на 30-е сутки после заражения вирулентными микобактериями высевы из легких и селезенок в группе контроля достоверно отличаются от всех опытных групп. В группах иммунизированных животных на 30-е сутки показатели обсемененности примерно на 2-3 порядка меньше, чем в контрольной группе (рис. 19). На 60-е сутки в контрольной группе все животные погибли, а в группах иммунизированных животных погибло 20-30 % животных.

Проведенные нами гистологические исследования показывают, что субъединичные противотуберкулезные вакцины вызывают у вакцинированных мышей иммунологическую перестройку, способную либо полностью защитить животное от заболевания туберкулезом, либо снизить тяжесть течения инфекции. Со стороны печени отмечали отклонения от нормы (инфильтраты, состоящие из лимфоцитов) только у мышей, иммунизированных вакциной BCG. В легких зараженных мышей, предварительно иммунизированных только вакциной BCG или в сочетании с субъединичными вакцинами, отмечено развитие лобарной пневмонии, что, возможно, обусловлено высокой чувствительностью мышей линии С57Bl. Гистопатоморфологические исследования селезенок вакцинированных мышей свидетельствуют, что использование вакцины BCG-1, в сочетании с субъединичными вакцинами, активно стимулирует иммунитет к штамму М. tuberculosis H37Rv. В селезенке красная пульпа заполнена в основном большим количеством лимфатических клеток и очагами гипертрофированных макрофагов (рис. 20А). В лимфатическом узле в корковой зоне и на небольших участках среди плазматических клеток преобладают лимфоциты (рис. 20Б).

Рисунок 19 - Показатели высевов микобактерий из легких (А) и из селезенки (Б) на 30-е и 60-е сутки после ретроорбитального заражения мышей линии С57Bl клетками вирулентного штаммом М. tuberculosis H37Rv в дозе 5х106 КОЕ/мышь, предварительно иммунизированных: 1 - однократно BCG-1; 2 – трехэтапно BCG-1, «Ag85A-DBD» и «Ag85A-DBD» с интервалами 15 дней; 3 – однократно совместно субъединичными вакцинами «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD»; К - контроль – неиммунизированные животные (обработка физраствором)

Рисунок 20 – Микрофотография гистологических срезов селезенки, увеличение 40х (А) и лимфатического узла, увеличение 20х (Б) мышей линии C57BL, иммунизированных генноинженерными вакцинами «Ag85ADBD» и «ESAT6DBD»

Активацию клеточного звена иммунитета мышей подтверждали результатами реакции бласттрансформации спленоцитов (РБТЛ). Пролиферацию лимфоцитов оценивали по усилению их митохондриального дыхания. Результаты изучения клеточной пролиферации при культивировании спленоцитов вакцинированных животных в среде, содержащей генноинженерные антигены туберкулезного микроба Ag85В-(His)6 и ESAT-6-(His)6 (любезно предоставленные нам к.б.н. Кравченко Т.Б., отдел особо опасных инфекций ФБУН ГНЦ ПМБ) или конковалин А (КонА) свидетельствуют, что неспецифический стимулятор бласттрансформации КонА и антигены Ag85В-(His)6 и ESAT-6-(His)6 вызывают усиление пролиферации спленоцитов во всех группах иммунизации. Особый интерес представляют данные по изучению влияния на спленоциты вакцинированных животных самих вакцинных препаратов. В разведении 1/100 они оказывали стимулирующее воздействие на спленоциты (в 2-3 раза), а в разведении 1/10 – супрессирующее (рис. 21).

Рисунок 21 - Индекс стимуляции в супернатанте спленоцитов, выделенных от иммунизированных мышей, в ответ на генноинженерные антигены туберкулезного микроба, КонА (2 мг/л) и субъединичные вакцины: 1 – конковалин А; 2 – ультразвуковой дезинтеграт клеток вакцинного штамма BCG; 3 – генноинженерный антиген ESAT-6-(His)6; 4 генноинженерный антиген Ag85В-(His)6; 5 – вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:100; 6 –вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:10

Для оценки эффективности вакцинации мышей генноинженерными вакцинами изучали уровень цитокинов IFN- и IL-4 в супернатанте лимфоцитов, выделенных от иммунных мышей и культивируемых в среде, содержащей антигенные препараты: ультразвуковой лизат клеток вакцинного штамма BCG (108 КОЕ/мл), рекомбинантные антигены Ag85В-(His)6 и ESAT-6-(His)6 – (2 мг/л), конковалин А (2 мг/л) и вакцину «Ag85A-DBD» в разведении 1/10 и 1/100, по сравнению с аналогичными показателями для лимфоцитов, выделенных от неиммунных мышей.

Cпецифический клеточный ответ на ультразвуковой лизат живой противотуберкулезной вакцины BCG выявлен только у животных, иммунизированных вакциной BCG. У этих животных зафиксирован уровень IFN- в 4 раза более высокий, чем у животных в других группах. Удивительным кажется факт, что у животных получивших иммунизацию как живой, так и субъединичной вакцинами, клеточного ответа на туберкулезные антигены не сформировалось (рис. 22).

Изучение продукции IL-4 спленоцитами экспериментальных животных позволяет косвенно судить о формировании гуморального иммунитета. Результаты свидетельствуют о невысоком уровне продукции этого цитокина в ответ на стимуляцию лимфоцитов антигенами. Очень интересен факт, что количество IL-4 в супернатанте спленоцитов, полученных от животных, иммунизированных только субъединичными вакцинами, достоверно выше, чем в супернатантах спленоцитов, выделенных от животных, иммунизированных по другим схемам. Таким образом, иммунизация субъединичной вакциной больше стимулирует образование антител на все использованные туберкулезные антигены.

Для подтверждения адекватности разработанной модели туберкулезной инфекции для тестирования субьединичных противотуберкулезных вакцин проведено сравнение результатов иммунизации мышей с данными, полученными на модели морских свинок, вакцинированных по аналогичным схемам «prim-boost». На рис. 23 и 24 приведены показатели высевов из легких и селезенки мышей линии С57Bl и морских свинок, предварительно иммунизированных различным способами, на 30-е сут. после ретроорбитального заражения вирулентным штаммом М. tuberculosis H37Rv.

Рисунок 22 - Уровень продукции гамма-интерферона в супернатанте спленоцитов, выделенных от иммунизированных мышей, в ответ на генноинженерные антигены туберкулезного микроба, КонА (2 мг/л) и субъединичные вакцины: 1 – конковалин А; 2 – ультразвуковой дезинтеграт клеток вакцинного штамма BCG; 3 – генноинженерный антиген ESAT-6-(His)6; 4 генноинженерный антиген Ag85В-(His)6; 5 – вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:100; 6 –вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:10

Рисунок 23 - Уровень продукции интерлейкина IL-4 в супернатанте спленоцитов, выделенных от иммунизированных мышей, в ответ на генноинженерные антигены туберкулезного микроба, КонА (2 мг/л) и субъединичные вакцины: 1 – контроль (среда без антигенов); 2 – конковалин А; 3 – ультразвуковой дезинтеграт клеток вакцинного штамма BCG; 4 – генноинженерный антиген ESAT-6-(His)6; 5 генноинженерный антиген Ag85В-(His)6; 6 – вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:100; 7 –вакцина «Ag85A-DBD» в разведении 1:10

Рисунок 24 - Показатели высевов микобактерий из легких и селезенок мышей линии C57Bl, зараженных ретроорбитально (A) и морских свинок, зараженных аэрозольно (Б), на 30-е сутки после заражения клетками вирулентного штамма М. tuberculosis H37Rv: 1 вакцинация однократно BCG; 2 трехэтапно BCG-1, «ESAT6-DBD» и «ESAT6-DBD»; 3 однократно совместно субъединичными вакцинами «Ag85A-DBD» и «ESAT6-DBD»; К - контроль – неиммунизированные животные (обработка физраствором)

Таким образом, испытание экспериментальных образцов новых субъединичных кандидатных противотуберкулезных вакцин, созданных на основе белков антигенного комплекса туберкулезного микроба Ag85, первично-секретируемого антигена туберкулезного микроба ESAT-6, на мышиной «внутривенной» модели и «аэрозольной» модели морских свинок показало, что вакцинация животных данными препаратами по схеме «prime-boost» эффективно защищает животных от гибели при заражении вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv.

Глава 7. ОЦЕНКА ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ И ЛЕЧЕБНОЙ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛИПОСОМИРОВАННЫХ ЭФИРНЫХ МАСЕЛ РАСТЕНИЙ (ЛЭМР)

НА БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЯХ


Изучение эффективности действия комплексных липосомальных препаратов эфирных масел растений на моделях in vitro


Изучение ЛЭМР на моделях in vitro проводили с целью выяснения их действия на клетки макроорганизма, участвующие в защитных реакциях при инфицировании возбудителем туберкулеза.

Бактерицидные свойства ЛЭМР в отношении возбудителя туберкулеза оценивали in vitro на лабораторном штамме М. tuberculosis H37Rv и MDR штаммах М. tuberculosis. Показано, что фитоэкстракты трех видов растений – бархатцев Tagetes patula, монарды Monarda fistulesa и сосны Pinus silvestris, а также ЛЭРМ, включающие композицию фитоэкстрактов, обладают бактерицидным эффектом против возбудителя туберкулеза (табл. 2, 3).

Таблица 2 – Бактерицидный эффект эфирных масел и липосомированных препаратов в отношении клеток M. tuberculosis H37Rv

Таблица 3 Количество КОЕ MDR штаммов M. tuberculosis

после совместного инкубирования с эфирными маслами и ЛЭМР

Цитотоксические свойства ЛЭМР тестировали на перевиваемых клеточных культурах человека L929 и HelaS3, а также мыши J774 методами МТТ и АТФ-хемилюминисценции. Показано отсутствие токсичности препаратов ЛЭМР для клеток данных линий в концентрациях 1-2 мг/л. Сами эфирные масла монарды, бархатцев и сосны в концентрациях 1-2 мг/л также не были токсичны для культур клеток, в то время как в концентрациях 10 и 20 мг/л они вызывали дозозависимое снижение жизнеспособности макрофагов мыши in vitro (до 30-40 %) и нейтрофилов периферической донорской крови человека (до 20 %).

Способность клеток M. tuberculosis к переживанию в макрофагах клеточной линии J774. при добавлении в среду культивирования ЛЭМР или его компонентов достоверно снижается. Можно предположить, что данные препараты способствуют завершению фагоцитоза патогена (киллингу микроорганизмов) клетками линии J774 (рис. 25).

Рисунок 25 – Переживание микобактерий внутри макрофагов линии J774 в присутствии ЛЭМР и его компонентов

Продукция активных форм кислорода («окислительный взрыв») нейтрофилами перитонеального эксудата мышей через сутки совместной инкубации достоверно увеличивалась под влиянием ЛЭРМ и его компонентов, что сопровождалось увеличением бактерицидного потенциала фагоцитов (результаты получены на основании данных хемилюминесценции).


Изучение эффективности лечебного действия комплексных липосомальных препаратов эфирных масел растений на течение туберкулеза у лабораторных животных

Разработанная нами модель хронического туберкулеза мышей линии C57Bl позволяет формировать партии лабораторных животных, у которых стабильно (в течение 6-18 месяцев) поддерживается постоянная концентрация возбудителя в паренхиматозных органах. Данная модель использована нами для оценки эффективности новых препаратов в системе комплексного лечения туберкулеза липосомированных эфирных масел растений (ЛЭМР). Предпосылкой для использования данных веществ в качестве противотуберкулезных средств на животных моделях явились результаты тестирования нами бактерицидных и фунгицидных свойств ЛЭМР на культурах бактерий и грибов (С.В. Ивашов и др., 2012).

Изучение действия ЛЭРМ на модели хронического туберкулеза у мышей, вызванного у них внутрибрюшинным заражением клетками штамма M. tuberculosis H37Rv, проводили с учетом результатов предварительных экспериментов по определению концентраций ЛЭРМ, эффективных для обработки животных. Для этой цели впервые предложено использовать аэрозольную камеру GLAS-COLL (США), которая позволяет контролировать дозу препарата, получаемого животным. Экспериментально установлено, что аэрогенная доставка ЛЭМР больным хроническим туберкулезом животным ежедневно в течение 20-30 сут снижала у них количество (КОЕ) микобактерий на два порядка (табл. 3).

Таблица 3 – Количество микобактерий в легких мышей линии С57Bl после аэрозольного лечения препаратами ЛЭРМ

При аэрозольной обработке препаратами ЛЭРМ мышей линии C57Bl, больных туберкулезом в острой форме (после ретроорбитального введения клеток М. tuberculosis H37Rv в дозе 106 КОЕ/мышь) в течение 7 дней, смертность подопытных животных от туберкулеза по сравнению с контролем уменьшилась в два раза, а содержание микобактерий в органах – в 10 раз (рис. 26). Близкий эффект был получен также при обработке препаратами ЛЭРМ подстилки (измельченная бумага) в изоляторах для содержания животных.

Рисунок 26 – Количество мышей, болеющих острой формой туберкулеза, выживших при аэрозольном лечении ЛЭМР и аэрозольной обработке подстилки (А); количество КОЕ М. tuberculosis H37Rv в легких мышей на 10-й и 30-й дни лечения или обработки подстилки (Б)

Возможность использования ЛЭМР в качестве средств, предотвращающих передачу заболевания от больных туберкулезом животных здоровым, показана на модели острого туберкулеза у морских свинок. Через 30 дней после аэрозольного заражения морских свинок (n = 2) микобактериями штамма М. tuberculosis H37Rv и появления у них симптомов заболения (падение веса) к больным животным в микроизолятор подсаживали здоровых морских свинок (n = 8). Опытную группу животных с одной больной и четырьмя здоровыми морскими свинками обрабатывали аэрозольно ~2 мл препарата ЛЭМР. Контрольную группу животных один раз в сутки в течение этого же срока обрабатывали дистиллированной водой, после чего всех животных подвергали эфтаназии углекислым газом, вскрывали и делали высевы из гомогенатов их органов на плотную питательную среду 7Н11. По результатам микробиологического анализа органов животных, только одна из четырех опытных свинок была инфицирована M. tuberculosis, в то время как в контрольной группе инфицированными оказались все четыре подсаженные морские свинки (табл. 4).

Таблица 4 – Содержание клеток M. tuberculosis в органах больных острым туберкулезом и здоровых морских свинок после совместного их содержания в течение 55 дней

Оценка эффективности применения препаратов ЛЭМР в качестве профилактического и терапевтического противотуберкулезного средства в лечебно-профилактических учреждениях


Использование аэрозольной обработки помещений комплексным липосомальным препаратом ЛЭМР «Тагетоном» в условиях туберкулезного диспансера проводили с учетом результатов испытания данного препарата на биологических моделях. В исследовании участвовали добровльцы из числа больных с различными формами активного туберкулеза легких (n = 128).

Больные были разделены на 2 группы: основная – 64 человека, проходившая лечение в помещениях при постоянной обработке аэрозолями ЛЭМР, и группа сравнения (контрольная) – 64 человека, палаты которых не обрабатывались. Группы больных отбирали по принципу аналогов.

Оценка показателей состояния больных ТБ в основной группе до применения ЛЭМР и через 3 месяца лечения по сравнению с контрольной группой больных, свидетельствует о положительном влиянии ЛЭМР на тяжесть течения туберкулезной инфекции у пациентов (табл. 6).

Таблица 6 Динамика клинических проявлений у больных туберкулезом при обработке помещений ЛЭРМ в течение 3 мес

Эффективность использования аэрозольной обработки препаратами ЛЭМР показана не только на моделях туберкулеза в культуре человеческих и мышиных клеток нейтрофилов и макрофагов, а также на животных моделях (мышиной и морских свинок) и в процессе комплексного лечения больных людей в условиях туберкулезного диспансера.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ


В ходе проведенных нами исследований разработана новая биологическая модель хронического туберкулеза на мышах линии C57Bl, формирующегося у экспериментальных животных после внутрибрюшинного заражения их клетками штамма M. tuberculosis H37Rv в дозе ~105 КОЕ/животное.

Предложенная модель позволила получить новые знания о механизмах патогенеза хронического туберкулеза: подтверждена роль секретируемых белков Rpf M. tuberculosis H37Rv в активации хронического туберкулеза и переходе в острый инфекционный процесс; показано, что важную роль индукторов в этом процессе могут играть иммуномодулирующие вещества, такие как бактериальный липополисахарид, антитела к ФНО или аминогуанидин.

На биологических моделях впервые показана разная степень аттенуации «двойных», «тройных» и «четверных» нокаутных по генам rpf мутантов штамма М. tuberculosis H37Rv; максимально выраженная аттенуация определяется у «четверного» мутанта M. tuberculosis H37Rv rpfA rpfB rpfC rpfD. Данный штамм не реактивируется в организме животных и обеспечивает им защиту от заражения вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. Указанные свойства «четверного» мутанта позволяют рекомендовать его в качестве кандидатного штамма при создании новой живой противотуберкулезной вакцины.

Другим важным для практической биотехнологии результатом, полученным на разработанной модели хронического туберкулеза, явилось испытание новых адъювантов, необходимых при конструировании субъединичных вакцин. Предложенная модель позволила нам отобрать и рекомендовать в качестве адъюванта для новых генноинженерных субъединичных вакцин декстран 500, который не вызывают реактивацию хронического туберкулеза. Экспериментально показано, что вакцинация мышей по схеме «prime-boost», включающая в себя первичную иммунизацию («prime») живой противотуберкулезной вакциной BCG и последующую ревакцинацию («boost») субъединичными противотуберкулезными вакцинами, созданными на основе антигенных туберкулезных комплексов Ag85 и ESAT-6, обеспечивает высокий уровень защиты морских свинок и мышей от заражения туберкулезом.

Использование разработанной модели хронического туберкулеза позволило обосновать нам целесообразность применения липосомированных эфирных масел растений в практике комплексного лечения туберкулеза в условиях противотуберкулезных диспансеров. Было показано, что аэрозольная обработка помещений лечебно-профилактических учреждений препаратами липосомированных растительных эфирных масел обеспечивает улучшение показателей микробной чистоты воздуха, а также клинических показателей у туберкулезных больных (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля и др.).

ВЫВОДЫ

1. Разработана модель хронического туберкулеза на мышах линии C57Bl, которая воспроизводится у животных внутрибрюшинным заражением их клетками вирулентного штамма M. tuberculosis H37Rv в дозе ~104 – 105 КОЕ/мышь. Модель характеризуется наличием в паренхиматозных органах животных в незначительных количествах (103 – 104 КОЕ/орган) патогена на протяжении 4 – 18 мес; разброс показателей КОЕ M. tuberculosis H37Rv в органах мышей одной группы не превышает 20 – 30 %, летальность среди животных при данной форме инфекции составляет на протяжении 18 мес не более 10 %.

2. Рзработанная модель хронического туберкулеза пригодна для изучения реактивации туберкулезного процесса у животных после обработки их иммуномодуляторами: липополисахаридом E. coli, аминогуанидином и моноклональными антителами анти-ФНО.

3. На модели хронического туберкулеза мышей показано, что количество инактивированных rpf генов в нокаутных мутантах штамма M. tuberculosis H37Rv коррелирует с их способностью к реактивации в организме модельных животных под воздействием ЛПС E. coli, аминогуанидина и анти-ФНО моноклональных антител. Наименьшая степень реактивации выражена у «четверного» мутанта M. tuberculosis H37RvrpfA rpfB rpfC rpfD. Для этого штамма также характерна максимальная аттенуация и способность обеспечивать защиту иммунизированных животных от аэрозольного заражения вирулентным штаммом туберкулезного микроба; штамм M. tuberculosis H37RvrpfA rpfB rpfC rpfD может быть предложен для дальнейшего изучения в качестве кандидата для создания живой противотуберкулезной вакцины.

4. Разработанная модель хронического туберкулеза у мышей пригодна для оценки адъювантов по их способности реактивировать туберкулезный процесс у животных. С помощью этой модели подобран адъювант для конструируемой субъединичной противотуберкулезной вакцины – полисахарид декстран 500. Адъювант обладает низкой токсичностью и неспособен активировать хронический туберкулез. Вакцины на основе антигенных комплексов туберкулезного микроба Ag85«Ag85A-DBD» и ESAT6 «ESAT6-DBD» и декстрана 500 защищают мышей от острого туберкулеза, вызываемого у животных внутривенным и аэрозольным заражением вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv.

5. На модели хронического туберкулеза у мышей продемонстрирован противотуберкулезный эффект препаратов спреевых форм липосомированных растительных эфирных масел: аэрозольная обработка препаратом мышей, больных хроническим туберкулезом, обеспечивала снижение количества микобактерий в органах животных в 5 - 10 раз по сравнению с контрольными животными. Показано, что препараты ЛЭМР вызывают «окислительный взрыв» фагоцитов, выражающийся в увеличении уровня хемилюминесценции макрофагоподобных клеток перевиваемых клеток J774 и перитонеальных макрофагов мышей in vitro.

6. На модели острого туберкулеза у морских свинок установлен профилактический противотуберкулезный эффект спреевых форм липосомированных эфирных масел растений: распыление ЛЭМР предотвращало заражение здоровых морских свиной туберкулезом при содержании их в замкнутом пространстве вместе с животными, больными острым туберкулезом.

7. Испытание спреевых форм липосомированных растительных эфирных масел в условиях ряда лечебно-профилактических учреждений Москвы и Московской области показано, что аэрозольная обработка помещений данными препаратами способствует уменьшению микробного числа в воздухе помещений, а также улучшению клинических показателей (вес тела, формула крови, содержание возбудителя в мокроте, интенсивность кашля) у туберкулезных больных.


Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) статьи в рецензируемых научных журналах

  1. Biketov, S.F. Culturability of Mycobacterium tuberculosis cells isolated from murine macrophages: a bacterial growth factor promotes recovery. / S.F. Biketov, G.V. Mukamolova, V.D. Potapov, E.L. Gilenkov, G. Vostroknutova, D.B. Kell, M. Young, A.S. Kaprelyants // FEMS Immunol. Med. Microbiol. – 2000. – Vol. 29. – P. 233-240 (Цитирование в РИНЦ - 42).
  2. Potapov V.D. Immunomodulatory properties of 2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclopyrophosphate and search for its new derivatives / Potapov VD, Biketov SF, Demina GR, Lysak EI, Titareva GM, Bakhteeva IV, Ostrovski DN // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. – 2001. – Vol. 37. No. 3. – P. 274-278
  3. Герасимов,В.Н. Особенности тонкой структуры микобактерий туберкулеза, культивируемых в макрофагах мышей. / В.Н. Герасимов, С.Ф. Бикетов, Е.А. Голов, В.Д. Потапов, И.В. Бахтеева, О.Г. Николаева // Пробл. туберк. 2003. № 7. – С. 5257
  4. Потапов, В.Д. Действие фосмидоцина на развитие некоторых инфекций у мышей. /В.Д. Потапов, И.В.Бахтеева, В.Н.Борзенков, Г.М.Титарева, J.Wiesner, В.И.Бинюков, Д.Н.Островский, С.Ф.Бикетов // Антибиот. химиотер. 2003. Т. 48. № 2. С. 912.
  5. Biketov, S. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. / S. Biketov, V. Potapov, E. Ganina, K. Downing, B. Kana, A. Kaprelyants // BMC Infect. Dis. – 2007. – Vol. 17. – N 7. – P. 141146 (Цитирование в РИНЦ - 19).
  6. Шрамко, П.А. Моделирование хронической туберкулезной инфекции у мышей методом внутрибрюшинного заражения и анализ активации аминогуанидином мутантов штамма Mycobacteriumtuberculosis H37RV с делециями по генам rpf/ П.А.Шрамко, Н.С.Грищенко, Т.И.Рудницкая, В.Д. Потапов, А.С.Капрельянц, С.Ф.Бикетов // Туберк. бол. легк. 2010. № 4. – С. 4750.
  7. Kondratieva, T. Mycobacterium tuberculosis attenuated by multiple deletions of rpf genes effective lyprotects mice against TB infection. / T. Kondratieva, E. Rubakova, B.D. Kana, S. Biketov, V. Potapov // Tuberculosis (Edinb). – 2011. - Vol. 91. N 3. – P. 219-223.
  8. Ивашов, С.В. Оценка антимикробной активности липосомированных экстрактов некоторых видов растений для обработки воздуха помещений. / С.В. Ивашов, Е.Г., Михайлова Е.Г., Т.Х. Борзенкова, Г.Н. Вострокнутова, Н.В. Негрий, А.Ю. Ступин, Ф.А. Батыров, О.И. Чубатова, В.Д. Потапов, Н.К. Фурсова, С.А. Чубатова // Растит. ресурсы. – 2012. Т. 48. – Вып. 1. – С. 127137.
  9. Kaprelyants, A.S. Resuscitation-promoting Factors (Rpf): In Search of Inhibitors. / A.S. Kaprelyants, G.V. Mukamolova, A. Ruggiero, V.A. Makarov, G.R. Demina, M.O. Shleeva, V.D. Potapov, P.A. Shramko. // Prot. Pept. Lett. – 2012. – V. 19. - N 10. - P. 1026-1034.
  10. Михайлова, И.В. Новое направление в области профилактики туберкулеза / И.В. Михайлова, Е.В. Черный, З.Х. Корнилова, О.И. Чубатова, В.Д. Потапов, Г.А. Угодчиков, С.А. Чубатова // Безопасн. жизнедеят. – 2013. – Т. 5. № 149. – С. 2-8.

б) патенты

  1. Пат. RU №2452470 МПК7 H 04 В 1/38, Н 04 J 13/00. Композиция из взвеси липосом для профилактики и лечения воздушно-капельных инфекций, в частности туберкулеза (варианты) и способ ее аэрогенной доставки/ Чубатова С. А. (RU), Зурабов А. Ю. (RU), Чубатова О. И. (RU), Потапов В. Д. (RU), Вострокнутова Г. Н. (RU); заявители и патентообладатели Чубатова С. А. (RU), Зурабов А. Ю. (RU), Чубатова О. И. (RU), Потапов В. Д. (RU), Вострокнутова Г. Н. (RU) – № 201115717/15 ; заявл. 16.02.11 ; опубл. 10.06.12, Бюл. № 23 (II ч.). – 8с. : ил.

в) методические документы:

  1. Санитарные правила. Безопасность работы с микроорганизмами 1-2 групп патогенности (опасности). Изменения и дополнения 1 к СП1.3.1285-03. / авторы // М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010.
  2. Методические указания МУ 1.2. 2635-10. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. / авторы // М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010 г.

г) статьи в других изданиях

  1. Островский, Д.Н. Исследование новых метаболитических путей у бактерий как путь к улучшению биобезопасности. / Д.Н. Островский, С.Ф. Бикетов, В.И. Бинюков, И. Виснер, Г.Р. Демина, В.Д. Потапов, А.С. Шашков, М. Шлоттер, М. Эберль // В сб: «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов». Воронеж, 2003. - Вып. 5. – С. 417.
  2. Шрамко, П.А. Воздействие иммунодепрессантов на течение хронической туберкулезной инфекции у мышей. / П.А. Шрамко, С.Г. Аббасова, Н.С. Грищенко, Т.И. Рудницкая, В.Д. Потапов, А.С. Капрельянц, С.Ф. Бикетов, И.А. Дятлов // Современные проблемы инфекционной патологии: сб. науч. тр. – Минск, 2009. Вып. 2. С. 482486.
  3. Потапов В.Д. Современный метод ароматерапии или новое направление в использовании липосом / С.А. Чубатова, В.Д. Потапов, О.И. Чубатова // Сырье и упаковка. – 2011. – Т. 10. № 125. С. 1720.

д) тезисы докладов на научных конференциях:



Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:

«Шамова Ольга Валерьевна Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«Сабарайкина Светлана Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КРАСНЫХ СМОРОДИН ПОДРОДА RIBESIA L. В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2009 Работа выполнена в филиале Ботанический сад Института биологических проблем криолитозоны СО РАН. Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич кандидат...»

«Золотарева Наталья Владимировна Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2011 Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

«ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Ростов-на-Дону 2013 Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУН ГНЦ ПМБ ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный...»

«ШАРПАН Мария Владимировна МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРЯ 03.00.16 – Экология (физико-математические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук К раснодар 200 8 Работа выполнена на кафедре прикладной математики ГОУ ВПО К убанский государственный...»

«ЕЛИСТРАТОВА Людмила Леонтьевна КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АКНЕПОДОБНЫХ ДЕРМАТОЗОВ, ОСЛОЖНЕННЫХ ДЕМОДЕКОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Министерства здравоохранения...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«МИНВАЛЕЕВ Ринад Султанович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ВНУТРИОРГАННОГО КРОВОТОКА ПРИ ИЗБРАННЫХ ПОЗАХ ЧЕЛОВЕКА (ПО ДАННЫМ ДОППЛЕРЭХОГРАФИИ) 03.00.13 - физиология человека и животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 1999...»

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«МАРКОВА Юлия Александровна ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ 03.02.03-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в ФГБУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования Министерства...»

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«Блохина Светлана Викторовна ЭПИЗО ОТО ЛОГИЯ ЦИСТНО ГО ЭХИНОКОККОЗ А В ОМСКОЙ О Б ЛАСТИ 03.00.19 - паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень - 2009 Работа выполнялась в ФГУ ВПО Омский государственный аграрный университет и в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО...»

«Артамонов Александр Юрьевич ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«Жадченко Юлия Викторовна Распространенность стафилококков в популяции лиц, живущих в крупном промышленном городе 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор...»

«УДК 579.22.577.121 ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном...»

«ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭПИЗООТОЛОГИЯ ТРЕМАТОДОЗОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРОТИВОТРЕМАТОДОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РЕСПУБЛИКЕ АЛТАЙ Специальность 03.02.11 - Паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2010 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук Научный...»

«МИХАЙЛОВА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА БИОЛОГИЯ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ КИШЕЧНЫЕ ИНФЕКЦИИ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских...»






 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.