WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Структура липополисахаридов и избирательная вирулентность возбудителей фоторабдоза

На правах рукописи







киршева надежда алексеевна




СТРУКТУРА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ

И ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ВИРУЛЕНТНОСТЬ

ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФОТОРАБДОЗА


03.02.03 – микробиология

03.01.04 – биохимия


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук






Оболенск – 2013

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:
Дентовская Светлана Владимировна – доктор медицинских наук
Книрель Юрий Александрович – доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Коломбет Любовь Васильевна – доктор биологических наук, заведующий научной частью ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Шепеляковская Анна Олеговна – кандидат биологических наук, старший научный сотрудник филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» Российской академии наук

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «25» октября 2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «24» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Род Photorhabdus семейства Enterobacteriaceae включает три вида подвижных биолюминесцентных почвенных грамотрицательных бактерий: Photorhabdus temperata, Photorhabdus luminescens и Photorhabdus asymbiotica. Бактерии всех трех видов – симбионты энтомопатогенных нематод семейства Heterorhabditidae, вместе с которыми вызывают гибель личинок широкого круга насекомых, что способствовало использованию P. luminescens в качестве биоинсектицида (Forst S. et al., 1997). Бактерии P. asymbiotica, в отличие от P. temperata и P. luminescens, патогенны для людей. К настоящему времени в клинической практике зафиксировано 18 случаев инфицирования людей (шесть в США и 12 в Австралии) бактериями P. asymbiotica (Gerrard J.G. et al., 2011). Не исключено, что благодаря трудностям при идентификации патогена число заболевших людей значительно выше, чем это отражено в научных публикациях (Gerrard J. et al., 2004). В ряде случаев бактерии P. asymbiotica, выделенные из клинических образцов, расценивали как вторичную микрофлору раневых поверхностей, но не этиологический агент заболевания. Изучение патогенности Photorhabdus spp. до настоящего времени фокусировалось на использовании в качестве экспериментальной модели насекомых (Hallem E.A. et al., 2007; Khush R.S., Lemaitre B., 2000; Tzou P. et al., 2002; Vodovar N. et al., 2004), поэтому для изучения фоторабдоза человека необходим подбор адекватных теплокровных модельных лабораторных животных.

Известно, что одним из основных факторов патогенности грамотрицательных бактерий является липополисахарид (ЛПС), а его структура определяет исход взаимодействия патогена с факторами врожденного иммунитета хозяина (Morrison D.C., Ryan J.L., 1987; Raetz C.R., Whitfield C., 2002; Montminy S.W., et al. 2006). Способность представителей рода Photorhabdus эффективно преодолевать врожденный иммунитет у насекомых, а в случае P. asymbiotica – и у людей, напоминает таковую у бактерий рода Yersinia – Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica – также патогенных и для насекомых, и для млекопитающих (Heermann R., Fuchs T.M., 2008). В то же время установлено, что образование наиболее вирулентного вида рода Yersinia – Y. pestis – сопровождалось существенным изменением структуры ЛПС, в том числе утратой способности синтезировать ЛПС с О–полисахаридной цепью (Skurnik M. et al., 2000). P. Wilkinson et al. (2009) высказали предположение о том, что в ходе инфекции у людей может модифицироваться структура ЛПС P. asymbiotica, как это происходит у других грамотрицательных патогенов, способных уклоняться от распознавания иммунной системой млекопитающего. Показано, что представители рода Photorhabdus синтезируют ЛПС в S–форме (Bennett H.P.J., Clarke D.J., 2005), включающий О–полисахарид (О–антиген), олигосахаридную часть (кор) и липид А, однако его структура до настоящей работы не была определена ни у одного из видов, входящих в этот род.





Систематическое структурное исследование ЛПС и изучение биологических свойств бактерий рода Photorhabdus, отличающихся по патогенности для человека, необходимы для выяснения механизмов избирательной вирулентности представителей различных видов Photorhabdus для теплокровного хозяина.

Цель исследования – получение новых сведений о структурной организации липополисахаридов и биологических свойствах бактерий рода Photorhabdus, связанных с патогенностью для человека.

Задачи исследования

1. Создать и охарактеризовать представительную коллекцию штаммов Photorhabdus spp.

2. Определить структуру ЛПС представителей различных видов и подвидов рода Photorhabdus и оценить характер влияния температуры выращивания штаммов Photorhabdus spp. на структуру ЛПС.

3. Сравнить биологические свойства штаммов Photorhabdus spp., отличающихся по патогенности для человека (вирулентность для мышей, устойчивость к катионным антимикробным пептидам и комплементу сыворотки крови, эндотоксическую активность ЛПС).

Научная новизна

Впервые установлены структуры О–полисахаридов рода Photorhabdus. В их составе обнаружены редко встречающиеся компоненты: D–глицеро–D–манно–гептоза и 3,6–дидезокси–3–формамидо–D–глюкоза в P. luminescens, 2–ацетамидо–4–амино–2,4,6–тридезокси–D–галактоза и 2аминоэтилфосфатное производное N–ацетил–D–галактозамина в P. temperata. Особенностью О–полисахаридов P. asymbiotica является присутствие необычного N–ацильного заместителя 2,4–диамино–2,4,6–тридезоксиглюкозы (Qui4N) – N–формилглицила, который ранее не был обнаружен в бактериальных полисахаридах.

Впервые определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС представителей трех видов рода Photorhabdus и обнаружено влияние температуры культивирования бактерий на содержание D–глицеро–D–манно–гептозы и степень фосфорилирования кора. Получены первые данные о степени ацилирования липида А Photorhabdus spp., позволившие обосновать одинаковую эндотоксическую активность in vivo препаратов ЛПС P. asymbiotica и P. luminescens с одной стороны и Y. pestis с другой стороны.

Впервые показано, что штаммы P. asymbiotica и P. luminescens, в отличие от штаммов P. temperata, патогенны для лабораторных мышей, и определены величины LD50 для мышей BALB/c представителей двух подвидов P. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis. Выявлена гетерогенность представителей трех видов Photorhabdus spp. по устойчивости к антимикробным катионным пептидам и комплементу нормальной человеческой сыворотки.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные фундаментальные сведения о тонком строении ЛПС Photorhabdus spp. открывают путь для функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов их биосинтеза. Обнаруженное структурное разнообразие О–полисахаридов Photorhabdus spp. при низком разнообразии структур P. asymbiotica на уровне подвидов имеют значение для уточнения таксономического положения изученных бактерий. Выявленное сходство О–полисахаридов P. asymbiotica и таксономически отдаленных микроорганизмов, включая Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio anguillarum, Francisella tularensis и Francisella novicida, проливает свет на эволюционную историю О–антигенов грамотрицательных бактерий. Продемонстрированное на мышиной модели соответствие P. asymbiotica третьему и четвертому постулатам ГенлеКоха (Koch R., 1882) окончательно доказывает этиологическую роль этих бактерий в развитии фоторабдоза теплокровных животных.

Создана и охарактеризована коллекция из 23 штаммов Photorhabdus spp., включающая штаммы, относящиеся к различным внутривидовым группам P. asymbiotica возбудителя нового инфекционного заболевания человека фоторабдоза. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ–Оболенск» (п. Оболенск, Московская обл.) депонировано 23 штамма Photorhabdus spp.

Выделенные из штаммов Photorhabdus spp. препараты ЛПС в настоящее время применяются в иммунологических исследованиях в отделе иммунобиохимии патогенных микроорганизмов ФБУН ГНЦ ПМБ (п. Оболенск, Московская обл.). Выявленные структурные особенности O–полисахаридных цепей ЛПС бактерий Photorhabdus spp. могут послужить основой для серологического типирования этих бактерий.

Разработанная мышиная модель фоторабдоза может быть использована для изучения формирования и течения экспериментальной фоторабдозной инфекции, а также создания эффективных схем антимикробной терапии заболевания.

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного естественно–научного института и аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ.

Методология и методы исследования

В исследовании использовались экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, методы аналитической химии углеводов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установленные структуры О–полисахаридов (O–антигенов) энтеробактерий рода Photorhabdus и идентифицированные в их составе компоненты, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, являются потенциальной основой для разработки схемы серотипирования бактерий этого рода.

2. P. asymbiotica соответствует всем четырем постулатам Генле–Коха и является этиологической причиной развития фоторабдоза теплокровных животных, а мыши линии BALB/c – адекватная модель для воспроизведения фоторабдоза человека.

3. Бактерии P. luminescens subsp. laumondii при подкожном введении в высокой дозе способны воспроизводить клиническую картину фоторабдоза, не вызывая гибели мышей линии BALB/c.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.

Основные положения диссертационной работы представлены на II Научно–практической школе–конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (25–27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.); 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (19–22 сентября 2010 г., Финляндия); III Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (28–30 марта 2011 г., Москва); III Научно–практической школе-конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (31 мая–2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.); 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2–6 сентября 2012 г., Суздаль).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 28 января 2010 г. (протокол № 1, приказ № 14 от 04 февраля 2010 г.) с изменениями, утвержденными на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 15 марта 2013 г. (протокол № 3). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 29 от 29 апреля 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе, три статьи в рецензируемых изданиях (из них одна – в отечественном, две – в международном) и пять работ – в материалах конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и список использованных источников, включающий 11 работ отечественных и 219 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами. Приложения состоят из двух статей, опубликованных по теме диссертации.

Основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

Объектами исследования служили 23 штамма Photorhabdus spp. (пять штаммов P. temperata, шесть – P. luminescens и 12 – P. asymbiotica), один штамм Y. pseudotuberculosis и один штамм E. coli, полученные из коллекций Университета Монпелье (Франция), Ирландского национального университета (Корк, Ирландия) и «ГКПМ–Оболенск» ФБУН ГНЦ ПМБ, а также мыши нелинейные породы Swiss Webster, линейные: BALB/c, C57BL/6, CBA и С3Н/НеN (19 ± 2) г.

Микробиологические методы

Бактерии выращивали на жидких или плотных питательных средах Luria–Bertani (LB) и Хоттингера. Для выделения ЛПС штаммы выращивали с аэрацией при температурах 28 °C или 37 °C в ферментере New Brunswick Scientific с рабочим объемом 5 л в жидкой среде LB при pH 7,1. Основные морфологические, культуральные и биохимические свойства полученных штаммов Photorhabdus spp. оценивали, как описано ранее (Givaudan A. et al., 1995; Farmer J.J. et al., 1989). Чувствительность штаммов Photorhabdus spp. к антибиотикам определяли методом дисков (Руководство по профилактике чумы, 1972). Определение минимальной подавляющей концентрации (МПК) полимиксина B (PMB) (AppliChem GmbH, Germany) проводили, как описано ранее (Hitchen P.G. et al., 2002). Бактерицидные свойства сывороток изучали по опубликованному протоколу (Barnes M.G. et al,. 2001).

Биохимические и аналитические методы

Препараты ЛПС из сухой бактериальной массы штаммов Photorhabdus spp. выделяли методом экстракции горячим водным фенолом (Westphal O., Jann K., 1965) и очищали последовательным ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот и белков с повторным ультрацентрифугированием (105000  g, 4 ч). Очищенные препараты ЛПС лиофилизировали. Содержание белка в препаратах ЛПС оценивали методом гель–электрофореза, а присутствие нуклеиновых кислот определяли, как описано ранее (Knirel Y.A. et al., 2005).

Мягким кислотным гидролизом ЛПС разделяли на углеводную и липидную компоненты. Углеводную часть (О–полисахарид, коровый олигосахарид или кор с присоединенным повторяющимся звеном О–полисахарида) фракционировали колоночной хроматографией на геле Sephadex G–50. Липидную часть (липид А) после отделения центрифугированием очищали от фосфолипидов экстракцией смесью хлороформ–метанол. Состав липида А изучали методом жирнокислотного анализа (ГЖХ метиловых эфиров, а в случае гидроксикислот – их триметилсилильных производных), а состав олигосахарида кора и О–полисахаридов – с помощью моносахаридного анализа (ГЖХ ацетилированных полиолов).

Установление строения выделенных низкомолекулярных компонентов (кора и липида А) проводили с помощью масс–спектрометрии высокого разрешения с ионизацией электрораспылением (Knirel Y.A. et al., 2005). Для установления полной структуры кора и О–полисахаридов использовали одномерную и двумерную спектроскопию ЯМР высокого разрешения на ядрах 1H, 13С и 31P (Kondakova A.N. et al., 2010, 2011). Сигналы в спектрах ЯМР О–полисахаридов были отнесены с помощью двумерной корреляционной спектроскопии 1H, 1H COSY (COrrelation SpectroscopY), TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY), ROESY (Rotating–frame nuclear Overhauser Effect SpectroscopY, спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат), 1H,13C HSQC (Heteronuclear Single–Quantum Coherence, гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия) и HMBC (Heteronuclear Multiple Bonds Correlation, гетероядерная корреляция через несколько связей).





Биологические и гистологические методы

Летальную токсичность препаратов ЛПС определяли титрованием на интактных и актиномицин Д–сенсибилизированных мышах (Дентовская С.В. и др., 2008).

Оценку вирулентности проводили на мышах линий BALB/c, C57BL/6, CBA, С3Н/НеN и беспородных белых мышах при подкожном (п/к) и внутрибрюшинном (в/б) введении десятикратных разведений (от 108 КОЕ до 1 КОЕ) 28–градусных культур Photorhabdus spp. в изотоническом растворе NaCl в объеме 0,2 мл на животное (по четыре животных в группе). Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 21 сут. Погибших в ходе эксперимента и умерщвленных после его завершения животных вскрывали, органы и ткани подвергали бактериологическому исследованию.

Препараты для гистологических исследований готовили, как описано ранее (Меркулов Г.А., 1969). Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали раствором гематоксилин–эозина (Лили Р., 1969) и микроскопировали под иммерсией в проходящем свете.

Статистическая обработка результатов и программное обеспечение

Математическую обработку полученных данных проводили с использованием компьютерной программы Excel для Windows версии 2010, рассчитывая среднюю арифметическую, стандартную ошибку средней арифметической, доверительный интервал. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием критерия Стьюдента (р < 0,05). При определении эндотоксической активности препаратов ЛПС и вирулентности штаммов вычисление величин LD50, а также доверительных интервалов (для вероятности 95 %) проводили по методу Karber в модификации И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Создание и характеристика рабочей коллекции

представителей Photorhabdus spp.

В рамках настоящей диссертационной работы создана коллекция, состоящая из 23 штаммов Photorhabdus spp., принадлежащих к видам asymbiotica, temperata и luminescens. Набор штаммов P. asymbiotica включает два подвида: subsp. asymbiotica (US87, US86, US77, US88) и subsp. australis (AU97, AU92, AU88, AU81, AU46, AU36), а также группу штаммов P. asymbiotica (OnIr40, CbKj163), выделенных в Японии, подвидовая принадлежность которых в настоящее время не определена. По данным R. Kuwata et al. (2008) они занимают промежуточное положение между подвидами australis и asymbiotica. Из пяти штаммов P. temperata три принадлежат к subsp. cinerea (3240, 3107T, 3014) и два к subsp. temperata (K122, XlNachT). Вид P. luminescens представлен штаммом P. luminescens subsp. laumondii TT01T и его производными с мутациями в генах биосинтеза ЛПС (TT01#28F4, TT01#6D10, TT01#6Е10), а также штаммами P. luminescens subsp. luminescens HbT и P. luminescens subsp. akhurstii FRG04.

Основные морфологические, культуральные и биохимические свойства полученных штаммов Photorhabdus spp. соответствовали данным, используемым для определения видовой принадлежности представителей рода Photorhabdus. Согласно полученным результатам культуры Photorhabdus spp. оказались высокочувствительными к широкому спектру антимикробных препаратов активных против грамотрицательных бактерий, включая карбапенемы группы –лактамов, тетрациклины, амфениколы, фторхинолоны, аминогликозиды. Большинство изолятов были слабочувствительными к макролидам и устойчивыми к линкозамидам. Учитывая спектр лекарственной устойчивости имеющихся в нашем распоряжении штаммов, практикующим врачам при лечении фоторабдоза необходимо уделять внимание выбору эффективных терапевтических антибактериальных препаратов.

Для получения препаративных количеств ЛПС из штаммов Photorhabdus spp. с целью определения химической структуры требуются значительные количества сухой биомассы, выращенной в стандартных условиях. Поэтому для культивирования 15 штаммов Photorhabdus spp. при температуре 28 °C и одного штамма, P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 при температурах 28 °C и 37 °C в настоящем исследовании впервые использовали лабораторный ферментер New Brunswick Scientific BioFlo 110 с рабочим объемом реактора 5 л. Все исследованные культуры Photorhabdus независимо от вида показывали сходную динамику роста с переходом к стационарной фазе через 8–10 ч от начала ферментации. Одна ферментация позволяла получить от 3,5 г до 11,0 г сухой биомассы и от 35 мг до 151 мг ЛПС после экстракции, очистки и лиофилизации.


Химическая структура ЛПС представителей Photorhabdus spp.

Электрофоретическое разделение препаратов ЛПС, выделенных из штаммов P. asymbiotica по методу P. Hitchcock и T. Brown (1983), показало характерную картину «лесенки» полос ЛПС, соответствующих молекулам с высокомолекулярным О–полисахаридом различной длины (рис. 1), что позволило в качестве способа выделения препаративных количеств ЛПС выбрать метод экстракции горячим водным фенолом (Westphal O., Jann K., 1965).

Рисунок 1 Электрофоретическое разделение препаратов ЛПС P. asymbiotica в 15 % полиакриламидном геле с додецилсульфат натрия (ДСН). Окрашивание по методу C.M. Tsai и C.E. Frash (1982).

Треки представляют ЛПС из штаммов: 1 – US88; 2 – US87; 3 – US77; 4 – US86; 5 – AU36; 6 – AU46; 7 – AU81; 8 – AU88; 9 – AU92; 10 – AU97

Определенные впервые структуры О–полисахаридов патогенных для человека бактерий P. asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis, а также P. luminescens subsp. laumondii и P. temperata subsp. cinerea и subsp. temperatа приведены в таблице 1.

Таблица 1 Структуры Ополисахаридов бактерий рода Photorhabdus, установленные в настоящей работе

Штамм Структура Ополисахарида
P. asymbiotica subsp. australis AU46 3)--d-Quip4NGlyFo-(14)--d-GalpNAcA-(14)--d-GalpNAcA-(13)--d-QuipNAc-(1 3 6 OAc NH2
P. asymbiotica subsp. asymbiotica US87 3)--d-Quip4NGlyFo-(14)--d-GalpNAcA-(14)--d-GalpNAcA-(13)--d-QuipNAc-(1 3 6 3 OAc NH2 OAc
P. luminescens subsp. laumondii TT01T 2)--ddHepp-(13)--d-Galp-(13)--d-GlcpNAc-(13)--d-GlcpNAc-(1 3 1 -d-Quip3NFo
P. temperata subsp. сinerea 3240 3)--d-FucpNAc4N-(14)--d-GlcpA-(13)--D-GalpNAc4PEtN-(1
P. temprata subsp. temperatа XlNachT 2)--D-Manp-(13)--D-Galp-(13)--D-GalpNAc-(1 4 1 -3,6dHexp4OMe-(16)--D-Glcp

Принятые сокращения: GalNAcA 2–ацетамидо–2–дезоксигалактуроновая кислота, QuiNAc 2–ацетамидо–2,6–дидезоксиглюкоза, Quip4NFo 4,6–дидезокси–4–формиламиноглюкоза, Qui4NGlyFo 4,6–дидезокси–4–(N–формилглицил)аминоглюкоза, DDHep D–глицеро–D–манно–гептоза, Qui3NFo 3,6–дидезокси–3–формамидоглюкоза, FucNAc4N – 2–ацетамидо–4–амино–2,4,6–тридезоксигалактоза, DGalNAc4PEtN – 2–аминоэтилфосфатное производное N–ацетилгалактозамина, 3,6dHex4OMe 3,6дидезокси4Ометилксилогексоза (колитоза или абеквоза).

Изученные О–полисахариды представляют собой гетерополисахариды, построенные из линейных или разветвленных повторяющихся звеньев, размер которых варьируется от трисахарида до пентасахарида.

Проведенное исследование выявило идентичность полисахаридных структур внутри двух подвидов (asymbiotica и australis) вида P. asymbiotica. Единственное отличие заключалось в повышенной степени О–ацетилирования О–полисахаридов у штаммов subsp. asymbiotica. Особенностью установленных структур О–полисахаридных цепей представителей вида P. asymbiotica являлась природа N–ацильного заместителя Qui4N – N–формилглицила, который до настоящего времени не был обнаружен в качестве заместителя данного или другого аминосахара в составе бактериальных полисахаридов.

Установлено, что О–полисахариды P. asymbiotica имеют сходное строение с полисахаридами отдаленных в таксономическом отношении бактерий: Sh. dysenteriae type 7 (Knirel Y.A. et al., 1988), E. coli O121 (Parolis H. et al., 1997), P. aeruginosa O6 (Knirel Y.A. et al., 2006), V. anguillarum (Eguchi H. et al., 1992), F. tularensis (Vinogradov E.V. et al., 1991) и F. novicida (Vinogradov E. et al., 2004). Все они содержат дисахарид с различными 14–замещенными производными –D–GalNA, прикрепленными к N–ацетил–D–гексозамину (D–GlcNAc, D–QuiNAc или 2,4–диацетамидо–2,4,6–тридезокси–D–глюкоза) в положение 3. При этом наибольшим сходством обладали О–полисахариды P. asymbiotica и F. tularensis, различие между которыми заключались в природе N–ацильного заместителя Qui4N (формил или формилглицил); типе связи между повторяющимися звеньями (–12 или –13); аминировании одного или обоих остатков GalNAcA и присутствии или отсутствии О–ацетильных групп. Ранее было продемонстрировано, что наличие N–формильной группы на Qui4N – концевом остатке повторяющегося звена – необходимо для синтеза ЛПС с длинной полисахаридной цепью у вакцинного штамма F. tularensis 15. Биологическая роль О–полисахаридных цепей ЛПС P. asymbiotica и N–формилглицина как их специфического компонента требует дальнейшего изучения.

В составе О–полисахарида P. luminescens subsp. laumondii TT01T (табл. 1) обнаружены два редко встречающихся в бактериальных полисахаридах компонента: D–глицеро–D–манно–гептоза (DDHep) и 3,6–дидезокси–3–формамидо–D–глюкоза (D–Qui3NFo). DDHep ранее находили в О–специфических полисахаридах бактерий Plesiomonas shigelloides (Czaja J. et al., 2000) и Vibrio cholerae (Chowdhury T.A. et al., 1991; Ansari A.A. et al., 1986), а также в коре ЛПС различных бактерий. D–Qui3NFo до настоящей работы была обнаружена только однажды – в О–полисахариде Hafnia alvei 1204 (Katzenellenbogen E. et al., 1995). Расположение одного из этих необычных компонентов, а именно –D–Quip3NFo, в боковой цепи О–специфического полисахарида делает его наиболее доступным для клеток иммунной системы и антител, что позволяет предположить его доминирующий вклад в иммуноспецифичность P. luminescens subsp. laumondii TT01T.

В составе О–полисахарида P. temperata subsp. cinerea 3240 обнаружен еще один редко встречающийся аминосахар – 2–ацетамидо–4–амино–2,4,6–тридезокси–D–галактоза (D–FucNAc4N), а также 2–аминоэтилфосфатное производное N–ацетил–D–галактозамина (DGalNAc4PEtN). Так же как и структура О–специфического полисахарида P. luminescens, приведенная выше, эта структура является уникальной среди известных структур бактериальных углеводов. Благодаря одновременному присутствию кислотных функций (фосфатной группы и карбоксильной группы глюкуроновой кислоты) и основных функций (аминогрупп FucNAc4N и этаноламина) этот О–полисахарид имеет цвиттерионный характер.

В составе пентасахаридного повторяющегося звена О–полисахарида штамма P. temprata subsp. temperatа XlNachT обнаружен новый компонент полисахаридов – 3,6–дидезокси–4–О–метил–ксило–гексоза (колитоза или абеквоза, 3,6dHex4OMe). Полисахарид имеет разветвленную структуру с боковым дисахаридным ответвлением.

Строение кора ЛПС изучали в штаммах дикого типа всех трех видов рода Photorhabdus, а также в мутантных штаммах P. luminescens и культурах P. asymbiotica, выращенных при различных температурах (28 °С или 37 °С). При температуре 28 °С основной олигосахарид с полным углеводным скелетом из штамма P. asymbiotica subsp. australis AU46 имел по данным масс–спектра молекулярную массу 2139,641 Да и состав, показанный в таблице 2. Остальные олигосахариды этой же гликоформы содержали на один остаток фосфоэтаноламина (PEtN) больше или меньше, а в других гликоформах остаток гексозы заменен остатком гексозамина или отсутствуют один или два остатка гептозы или два остатка гептозы и один остаток гексозамина.

Детальное исследование строения основного олигосахарида P. asymbiotica AU46 с помощью двумерной ЯМР–спектроскопии позволило установить следующую структуру углеводного скелета: -GalNAc-(15)-(1S)-GaloNAc-(14,6)--GalN-(14)-[-DDHep-(12)]--GalA-(13)-[-Hep-(17)]--Hep-(13)-[-Glc-(14)]--Hep-(15)-Kdo, где Hep – L–глицеро–D–манно–гептоза, Kdo – 3–дезокси–D–манно–окт–2–улозоновя кислота. Остаток Kdo нестехиометрически замещен остатком 4–амино–4–дезокси–L–арабинозы (Ara4N). Положение PEtN–групп устанавливается.

Основная гликоформа кора P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 имела молекулярную массу 1906,547 Да и состав, показанный в таблице 2. Наряду с ней присутствовали также гликоформы, содержащие на один остаток гептозы больше или меньше.

Такой же углеводный скелет, что и у P. asymbiotica subsp. australis AU46, имел кор ЛПС P. temperata subsp. сinerea 3240 (табл. 2), отличающийся присутствием дополнительной фосфатной группы. У этой бактерии обнаружена также укороченная гликоформа кора, лишенная одного из остатков гептозы.

Углеводная структура внутренней области кора P. asymbiotica subsp. australis AU46 и P. temperata subsp. сinerea 3240 с одной стороны и всех бактерий рода Proteus с другой стороны сходны между собой: они включают общий гексасахаридный фрагмент -GalA-(13)-[-Hep-(12)-]--Hep-(13)-[-Glc-(14)]--Hep-(15)-Kdo, однако у бактерий Proteus spp. остаток GalA не замещен остатком DDHep, как это происходит у бактерий Photorhabdus spp. Особенностью внешних областей кора Photorhabdus spp. и некоторых штаммов Proteus spp. является присутствие остатка GalNAc в открытой (нециклической) форме (GaloNAc), присоединенного к остатку гексозамина со свободной аминогруппой.

Таблица 2 Химическая структура кора бактерий рода Photorhabdus

Подвид Штамм Структура основного олигосахаридаа
P. asymbiotica
subsp. australis AU46 Kdo1Hep4HexA1Hex1HexN1HexNAc2PEtN2
subsp. asymbiotica US77 Kdo1DDHep1Hep2HexA1Hex1HexN1HexNAc1PEtN2
P. temperata
subsp. сinerea 3240 Kdo1Hep4HexA1Hex1HexN1HexNAc2PEtN2
P. luminescens
subsp. laumondii TT01T Kdo1Hep2HexA1Hex2HexN1HexNAc1P1PEtN2
subp. lumninescens HbT Kdo1Hep4HexA2HexN1HexNAc1PenN1Lys1Gly1
subp. akhurstii FRG04 Kdo1Hep4HexA1Hex1PenN1P1PEtN3
а При температуре выращивания 28 °С.

Основной олигосахарид кора из P. luminescens subsp. laumondii TT01T имел молекулярную массу 1794,465 Да и состав, приведенный в таблице 2. Он является укороченным по сравнению с кором P. asymbiotica subsp. australis AU46, остаток HexNAc заменен в нем остатком Hex, и он имеет дополнительную фосфатную группу. По предварительным данным его углеводный скелет обладает следующей структурой: -Gal-(15)-(1S)-GaloNAc-(14,6)--GalN-(14)--GalA-(13)--Hep-(13)-[-Glc-(14)]--Hep-(15)-Kdo.

Отличительной особенностью кора липополисахарида P. luminescens subp. lumninescens HbT является присутствие аминокислот Lys и Gly. Наиболее полная гликоформа кора показана в таблице 2. Присутствуют также гликоформы, лишенные остатка HexNAc, остатка Lys или обеих аминокислот одновременно. Наиболее полная гликоформа P. luminescens subp. akhurstii FRG04 имела состав, приведенный в таблице 2.

Изучение влияния температуры выращивания на строение кора P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 показало, что при 37 °С основная гликоформа кора имеет молекулярную массу 1794,444 Да и состав Kdo1Hep2HexA1Hex2HexN1HexNAc1P1PEtN2 такой же, как у бактерии P. luminescens subsp. laumondii TT01T (табл. 2). Наряду с ней присутствовали олигосахариды с пониженным содержанием фосфата и фосфоэтаноламина, а также гликоформа, содержащая на один остаток DDHep больше. Таким образом, с повышением температуры в коре снижается содержание DDHep и одновременно повышается степень фосфорилирования.

В мутантных штаммах P. luminescens subsp. laumondii TT01#6E10 и P. luminescens subsp. laumondii TT01#6D10 наблюдали существенное укорочение кора. В штамме TT01#6 E10 кор ограничен только внутренней областью с различной степенью достройки. При кислотной деградации ЛПС получены олигосахариды следующего состава: Kdo1Hep2, Kdo1Hep2PEtN1, Kdo1Hep2Hex1, Kdo1Hep2PEtN2, Kdo1Hep2Hex1PEtN1 и Kdo1Hep2Hex1PEtN2. В интактном ЛПС основная форма кора имеет состав Kdo1Hep2Hex1PEtN1. В штамме TT01#6D10 основная форма кора имеет состав Kdo1Hep2HexA1HexN1Hex1P1PEtN2. Его углеводный скелет имеет следующую структуру, представляющую собой общий фрагмент коров всех видов Photorhabdus: -GalN-(14)--GalA-(13)--Hep-(13)-[-Glc-(14)]--Hep-(15)-Kdo.

Для мутантных штаммов P. luminescens TT01#6D10 и TT01#6E10 были получены предварительные данные по строению липида А. В обоих штаммах присутствовали пента– и гексаацильные формы липида А. Доминирующей была гексаацильная форма состава GlcN2P2(3HO14:0)4(14:0)1(12:0)1, характерная для липида А многих энтеробактерий, включая кишечную палочку. Однако у бактерий Photorhabdus spp. липид А отличается высокой степенью гетерогенности вследствие необычного присутствия жирных кислот с нечетным числом атомов углерода, а также замены кислоты 3HO14:0 на 3HO12:0, 12:0 на 14:0 и 14:0 на 16:0. Проводится более детальное изучение структуры липида А Photorhabdus spp.


Биологические свойства Photorhabdus spp., связанные с патогенностью

В настоящем разделе нашего исследования приведены результаты изучения эндотоксической активности, устойчивости к антимикробным пептидам и чувствительности к сыворотке крови представителей Photorhabdus spp., отличающихся по патогенности для человека и географическому происхождению.

Эндотоксическую активность препаратов ЛПС из штаммов Photorhabdus spp., выращенных при температуре 28 °С, оценивали по способности вызывать гибель мышей линии BALB/c, сенсибилизированных к эффектам ЛПС актиномицином Д (10 мкг/мышь), при внутрибрюшинном (в/б) введении (табл. 3).

Таблица 3 Токсичность препаратов ЛПС, выделенных из штаммов Photorhabdus spp., для актиномицин Дсенсибилизированных мышей

Источник ЛПС LD50, мкгa
P. asymbiotica subsp. australis AU46 250 (62,8–395,3)
P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 65 (20–515)
P. asymbiotica subsp. asymbiotica US86 435 (137,6–1732,9)
P. luminescens subsp. laumondii TT01T 170 (разброс слишком велик)
Y. pestis KM260(11) 89 (28–894)
F. tularensis 15/10 > 1000,00
a Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скобках.

Присутствие в препаратах ЛПС, выделенных из 28–градусных культур, пента– и гексаацильных форм липида А при доминирующем характере гексаацильной формы состава GlcN2P2(3HO14:0)4(14:0)1(12:0)1, характерной для липида А многих энтеробактерий, включая кишечную палочку, объясняет полученные нами результаты по высокой токсичности препаратов ЛПС P. asymbiotica subsp. australis, P. asymbiotica subsp. asymbiotica и P. luminescens subsp. laumondii, сопоставимой с токсичностью ЛПС из 28–градусных культур Y. pestis.

Для успешной колонизации и дальнейшего развития инфекции патогену необходимо противостоять внутренним защитным механизмам хозяина (Finlay B.B., Falkow S., 1997). Один из видов такой защиты млекопитающих и насекомых – продукция катионных антимикробных пептидов (Choi K.Y. et al., 2012). Подавляющее большинство «диких» штаммов Photorhabdus spp., выращенных при температуре 28 C, оказались высокоустойчивы к бактерицидной активности PMB (табл. 4). Только три штамма: один патогенный для людей, P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77, и два непатогенных – P. luminescens subsp. luminescens HbT и subsp. akhurstii FRG04 – были чувствительны к PMB при данной температуре культивирования. Нами высказано предположение, что устойчивость к полимиксину В «диких» штаммов возбудителя, выращенных при температуре 28 C (имитация пребывания бактерий в организме нематод и личинок насекомых) и относящихся к P. asymbiotica subsp. australis и subsp. asymbiotica, P. temperata subsp. cinerea и subsp. temperata и P. luminescens subsp. laumondii, как и у других энтеробактерий, связана с содержанием катионного компонента – Ara4N, присоединенного к фосфатным группам липида А, а также с наличием О–антигена и наружной области кора.

Устойчивость штаммов к бактерицидному действию сыворотки – одно из важнейших условий, необходимых для выживания и роста патогена в организме млекопитающих (Nolan L.K. et al., 2003). P. Wilkinson et al. (2008) впервые установили, что штамм P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 способен расти в присутствии нормальной человеческой сыворотки. Мы изучили влияние комплемента НЧС на жизнеспособность 20 штаммов Photorhabdus spp., принадлежащих к различным видовым/внутривидовым группам. Все 12 штаммов P. asymbiotica переживали действие комплемента НЧС, лишь у двух из них – OnIr40 и CbKj163, выделенных от энтомопатогенных нематод H. indica в Японии, наблюдалось двукратное снижение жизнеспособности клеток в процессе инкубации с НЧС по сравнению с инкубацией в тНЧС. «Дикие» штаммы другого вида – P. luminescens также обладали устойчивостью к действию сыворотки. Из пяти исследованных культур P. temperata устойчивостью обладал штамм P. temperata subsp. cinerea 3107T, у двух штаммов жизнеспособность снижалась на 2–3 порядка, а бактерии P. temperata subsp. cinerea 3240 и 3014 полностью гибли после инкубации с НЧС.

Известно, что в случае Burkholderia pseudomallei присутствие капсульного полисахарида необходимо для предотвращения связывания С3b компонента комплемента с клеточной поверхностью (Reckseidler–Zenteno S.L. et al., 2005). Возможно, что в случае P. asymbiotica феномен капсулообразования способен защитить микроорганизм от киллинга системой комплемента. Кроме того, в геноме штамма P. asymbiotica subsp. asymbiotica US77 обнаружен гомолог гена, кодирующего белок внешней мембраны Ail (OmpX) (Wilkinson P. et al., 2009), обеспечивающего устойчивость к сыворотке представителей рода Yersinia (Bartra S.S. et al., 2008). Установлено, что О–антиген играет главную роль в вирулентности таких грамотрицательных бактерий, как E. coli, Shigella spp., Klebsiella spp. Y. enterocolitica и Salmonella spp., обеспечивая устойчивость к комплементу и фагоцитозу (Bengoechea J.A. et al., 2004; Burns S.M. et al., 1998; Cortes G. et al., 2002; Murray G.L. et al., 2003). Однако, для установления роли капсулы, белка Ail или О–антигена в способности P. asymbiotica расти в человеческой сыворотке необходим сайт–направленный мутагенез указанных генетических локусов с последующей их комплементацией.

Таблица 4 Чувствительность штаммов Photorhabdus spp. к бактерицидной активности полимиксина В и комплемента нормальной человеческой сыворотки

Подвид Штамм МПК PMВ (мкг/мл) Lg КОЕ/млa жизнеспособных клеток после инкубации в:
НЧС тНЧС
P. asymbiotica
australis AU97 > 3000 5,89 ± 0,18 6,98 ± 0,13
AU92 > 3000 6,25 ± 0,22 7,10 ± 0,16
AU88 > 3000 6,35 ± 0,33 7,37 ± 0,36
AU81 > 3000 6,20 ± 0,19 7,20 ± 0,29
AU46 > 3000 5,33 ± 0,34 6,39 ± 0,14
AU36 > 3000 5,99 ± 0,02 6,96 ± 0,13
asymbiotica US87 > 3000 5,76 ± 0,18 6,87 ± 0,05
US77 1,25 5,91 ± 0,15 6,79 ± 0,08
US88 > 3000 4,95 ± 0,15 5,56 ± 0,34
US86 > 3000 5,70 ± 0,21 6,30 ± 0,16
OnIr40 > 3000 4,62 ± 0,18 6,40 ± 0,11
CbKj163 > 3000 4,18 ± 0,12 6,28 ± 0,14
P. temperata
cinerea 3240 > 3000 0 6,74±0,06
3107T > 3000 6,75±0,12 7,05 ± 0,02
3014 > 3000 0 6,03 ± 0,08
temperata K122 > 3000 4,46 ± 0,11 6,54 ± 0,10
XlNachT > 3000 2,48 ± 0,14 5,76 ± 0,20
P. luminescens
luminescens HbT 90 5,11 ± 0,17 6,18 ± 0,19
akhurstii FRG04 90 6,70 ± 0,09 5,85 ± 0,21
laumondii TT01T > 3000 4,0 ± 0,10 4,18 ± 0,18
laumondii TT01#28F4 2,5 4,62 ± 0,18 5,33 ± 0,34
laumondii TT01#6D10 2,5 0 7,00 ± 0,25
laumondii TT01#6E10 2,5 0 6,89 ± 0,07
Y. pseudotuberculosis EV11M 5 1,20 ± 0,05 7,1 ± 0,12
a Доверительный интервал вычисляли для вероятности 95 %.

Для доказательства этиологической роли патогенного микроорганизма в развитии конкретного инфекционного заболевания до сих пор принято использовать опубликованные R. Koch’ом в 1882 г. четыре классических критерия, постулата Генле–Коха (Greenberg D.E. et al., 2006; Koch R., 1882):

1. Микроорганизм должен быть найден во всех животных, страдающих от болезни.

2. Микроорганизм должен быть выделен от пораженного животного в чистой культуре.

3. Микроорганизм должен вызывать болезнь при заражении здоровых животных.

4. Микроорганизм должен быть повторно изолирован от экспериментально зараженного животного.

На момент начала наших исследований было доказано соответствие P. asymbiotica как этиологического агента фоторабдоза человека двум первым критериям (Gerrard J. et al., 2004; Gerrard J.G. et al.2003), но оставался открытым вопрос о третьем и четвертом постулатах в отношении не насекомых (Vlisidou I. et al., 2009; Yang G. et al., 2006), а теплокровных животных. Для решения этих вопросов мы попытались воспроизвести фоторабдоз на модели лабораторных животных. Кроме того, подбор адекватных модельных лабораторных животных необходим для изучения формирования и течения экспериментальной фоторабдозной инфекции и для разработки эффективных схем антимикробной терапии заболевания. Наиболее часто используемым объектом в биологии являются лабораторные мыши в силу невысокой стоимости, легкости разведения и ухода, а также достаточно высокой инфекционной чувствительности. Нам удалось воспроизвести экспериментальный фоторабдоз (с гибелью животных от наибльших заражающих доз) при п/к введении культуры P. asymbiotica subsp. australis AU81 мышам четырех линий: BALB/c, C57BL/6, CBA и С3Н/НеN. Беспородные белые мыши не гибли и не проявляли клинических признаков заболевания при заражении культурой P. asymbiotica AU81 (табл. 5).

Таблица 5 Вирулентность штамма P. asymbiotica subsp. australis AU81 для мышей

Линия/порода мышей Средние сроки гибели, сутки LD50, КОЕа
BALB/c 1,4 ± 0,4 3,2  106 (7,9  1051,3  107)
C57BL/6 1,2 ± 0,4 1,8  107 (5,6  1061,4  108)
CBA 1,4 ± 0,8 1,8  107 (5,6  1061,4  108)
С3Н/НеN 1,7 ± 0,6 3,2  106 (7,9  1051,3  107)
Беспородные > 108
а Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скобках.

Вирулентность штаммов представителей двух подвидов P. asymbiotica subsp. asymbiotica US86 и subsp. australis AU81, а также двух энтомопатогенных штаммов: P. temperata subsp. cinerea 3107T и P. luminescens subsp. laumondii TT01T изучали на мышах линии BALB/c. В связи с тем, что естественный путь заражения человека фоторабдозом пока не установлен, а инфекционная чувствительность модельных животных при разных способах введения культуры может значительно отличаться, использовали два способа заражения мышей: п/к и в/б. Как при п/к, так и при в/б способе введения гибель мышей, зараженных максимальными дозами P. asymbiotica AU81 и P. asymbiotica US86, наблюдали в течение первых трех суток. Средние сроки гибели для P. asymbiotica US86 составили при п/к заражении 2,7 ± 0,8 сут, при в/б – 1 сут, а для P. asymbiotica AU81 при п/к заражении – 1,4 ± 0,6 сут, при в/б – 1 сут. Отличия в величинах LD50 штаммов P. asymbiotica обоих подвидов при п/к способе введения были не достоверны (р > 0,05). При в/б введении LD50 для штамма P. asymbiotica subsp. australis AU81 была достоверно ниже аналогичного показателя для культуры P. asymbiotica subsp. asymbiotica US86 (р < 0,05) (табл. 6).

У погибших животных, зараженных культурами двух штаммов P. asymbiotica, в месте введения микробной взвеси наблюдали ярко–выраженную гиперемию и инъекцию сосудов подкожной клетчатки. В высевах из органов павших мышей (регионарный лимфоузел, печень, селезенка) и крови из сердца отмечали рост колоний заражающих штаммов. На восьмые сутки у части мышей, выживших после заражения P. asymbiotica AU81 и US86, на коже хвоста появились язвенные гнойно–некротические дермиты диаметром 1–3 мм (рис. 2, А).

Таблица 6 Вирулентность штаммов Photorhabdus spp. для мышей линии BALB/c

Штамм Photorhabdus spp. LD50, КОЕа
п/к заражение в/б заражение
P. asymbiotica subsp. asymbiotica US86 3,2  107 (1073,2  108) 5,6  107 (1,4  1072,8  108)
P. asymbiotica subsp. australis AU81 3,2  107 (1073,2  108) 106 (2,5  1054,0  106)
P. temperata subsp. cinerea 3107T > 108 > 108
P. luminescens subsp. laumondii TT01T > 108 > 108
а Доверительный интервал для вероятности 95 % указан в круглых скобках.

Бактериологические посевы их коростовых образований выявили рост чистых культур P. asymbiotica. Известно, что язвенно–некротические абсцессы мягких тканей являются характерными клиническими симптомами фоторабдоза человека (Gerrard J. et al., 2004). Появление отдаленных от места введения гнойно–некротических поражений кожи мышей подтверждает гематогенную диссеминацию возбудителя в ходе инфекционного процесса.

Подкожное введение энтомопатогенного штамма P. luminescens subsp. laumondii TT01T мышам линии BALB/c в дозе 108 КОЕ не приводило к их гибели в течение всего срока наблюдения (21 день). Однако на девятые сутки у всех мышей возникли язвенно–некротические изменения мягких тканей внутренней поверхности бедра в месте введения культуры (рис. 2, Б). В то же время мыши, зараженные P. temperata 3107T, оставались живыми и не проявляли клинических признаков инфекции на протяжении всего срока наблюдения.

А Б

Рисунок 2 Примеры патоморфологических изменений мягких тканей у мышей линии BALB/c.

(А) гнойно–некротические дермиты с ограниченной локализацией в коже хвоста после п/к введения культуры P. asymbiotica subsp. australis AU81 во внутреннюю поверхность бедра; (Б) язвенно–некротическое поражение мягких тканей внутренней и наружной поверхности бедра после п/к введения культуры P. luminescens subsp. laumondii TT01

Характер патоморфологических изменений органов мышей, павших после заражения штаммами двух подвидов P. asymbiotica AU81 и US86, был сходен. Имело место неравномерное полнокровие и стаз крови в кровеносных сосудах подкожной клетчатки. В легких отмечали выпадение фибрина в просвете кровеносных сосудов (рис. 3, А и Б). В печени наблюдали дистрофию и мелкоочаговый лизис гепатоцитов (рис. 3, В и Г). В почках – резкое полнокровие мозгового слоя. Кроме того, обнаружили делимфотизацию органов иммуногенеза, включая селезенку, лимфатические узлы, тимус. При этом штамм AU81 вызывал более тяжелое течение инфекции: наряду с указанной патологией имел место фиброзный тромбоз синусов селезенки (рис. 3, Д и Е), мелкоглыбчатый распад лимфоцитов в тимусе, проникновение и размножение микробов между складками слизистой оболочки в толстом кишечнике.

Реакция на введение непатогенного для теплокровных животных штамма P. temperata 3107T была ограничена образованием небольшого количества плазматических клеток в селезенке и лимфатических узлах.

Гибель экспериментальных мышей при заражении штаммами P. asymbiotica US86 и AU81, наблюдаемая в течение первых трех суток, была вызвана токсическим действием на организм и связана с расстройством гемодинамики, изменением свертываемости крови, нарушением лимфопоэза в органах иммуногенеза. Прямое токсическое повреждение клеток выявили только в печени и, для штамма P. asymbiotica AU81, в тимусе. Наиболее патогенным оказался штамм AU81 австралийского подвида как по тяжести патологии у павших, так и по длительности лейкоцитоза у выживших животных. Патологоанатомическим признаком заболевания являются гнойно–некротические язвы в коже выживших животных. Мыши линии BALB/c являются адекватной моделью для воспроизведения фоторабдоза человека, а P. asymbiotica соответствует третьему и четвертому постулатам Генле–Коха.

А Б
В Г
Д Е

Рисунок 3 Характер патоморфологических изменений в органах павших мышей линии BALB/c, зараженных культурой P. аsymbiotica AU81.

Исследованные органы: легкие контроль (А), легкие фоторабдоз (Б); печень контроль (В), печень фоторабдоз (Г); селезенка контроль (Д), селезенка фоторабдоз (Е)

* * *

Таким образом, полученные сведения о структурном разнообразии липополисахаридов представителей рода Photorhabdus заложили основу для серологического типирования бактерий, функциональной характеристики и оценки биологической роли отдельных генов биосинтеза ЛПС Photorhabdus spp., а также для разработки эффективных схем антимикробной терапии фоторабдоза с использованием теплокровных модельных животных.

ВЫВОДЫ

  1. Создана и охарактеризована коллекция, состоящая из 23 штаммов трех описанных к настоящему времени видов Photorhabdus P. asymbiotica, P. temperata и P. luminescens, являющаяся научным объектом для детального изучения возбудителя новой инфекции фоторабдоза.
  2. Установлено строение Ополисахаридов пяти подвидов, относящихся к трем видам Photorhabdus. Выявлены моносахариды, редко встречающиеся в бактериальных полисахаридах, которые благодаря их терминальному положению в О–полисахариде предположительно вносят наибольший вклад в иммуноспецифичность бактерий.
  3. Определена структура центрального олигосахарида (кора) ЛПС шести подвидов, относящихся к трем видам Photorhabdus. Обнаружено, что повышение температуры культивирования бактерий P. asymbiotica приводит к снижению содержания D–глицеро–D–манно–гептозы и одновременному повышению степени фосфорилирования кора.
  4. Впервые выявлена патогенность двух видов Photorhabdus в отношении мышей. Патогенные для людей бактерии P. asymbiotica обладали умеренной вирулентностью для мышей, вызывая при заражении в дозах 106–108 КОЕ клиническую картину инфекции, подобную таковой у людей, и гибель ~50–100 % животных. Бактерии P. luminescens subsp. laumondii вызывали у мышей нелетальный инфекционный процесс, проявляющийся в возникновении язвенно–некротических изменений мягких тканей в месте введения культуры, аналогичных наблюдающимся при заражении P. asymbiotica. Бактерии P. temperata subsp. cinerea непатогенны для мышей – реакция на их введение ограничивалась образованием небольшого количества плазматических клеток в селезенке и лимфатических узлах.
  5. Впервые показано соответствие P. asymbiotica третьему и четвертому постулатам Генле–Коха, что окончательно подтверждает роль этих бактерий в развитии фоторабдоза теплокровных животных.
  6. Установлено, что гибель мышей линии BALB/c при заражении штаммами P. asymbiotica вызвана инфекционно–токсическим шоком и связана с расстройством гемодинамики, изменением свертываемости крови и нарушением лимфопоэза в органах иммуногенеза. Эндотоксическая активность препаратов ЛПС P. asymbiotica близка к активности ЛПС Y. pestis.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК
  1. Kondakova, A.N. Low structural diversity of the O–polysaccharides of Photorhabdus asymbiotica subspp. asymbiotica and australis and their similarity to the O–polysaccharides of taxonomically remote bacteria including Francisella tularensis / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva, A.S. Shashkov, R.Z. Shaikhutdinova, N.P. Arabtsky, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Carbohydr. Res. – 2011. – Vol. 346. – N 13. – P. 1951–1955.
  2. Kondakova A.N. Structure of the O–polysaccharide of Photorhabdus luminescens subsp. laumondii containing D–glycero–D–manno–heptose and 3,6–dideoxy–3–formamido–D–glucose / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva, A.S. Shashkov, R.Z. Shaikhutdinova, N.P. Arbatsky, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Carbohydr. Res. – 2012. – Vol. 351. – P. 134–137.
  3. Киршева Н.А. Инфекционная чувствительность мышей линии BALB/c к заражению Photorhabdus asymbiotica и Photorhabdus temperata / Н.А. Киршева, Е.А. Ганина, Т.И. Комбарова, Р.З. Шайхутдинова, С.В. Дентовская, А.П. Анисимов // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов. – 2012. – T. 3. – № 113. – С. 64–66.

б) тезисы научных конференций

  1. Киршева Н.А. Строение O–полисахаридов Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica и subsp. australis / Н.А. Киршева, А.Н. Кондакова, Е.В. Чиркова, Р.З. Шайхутдинова, С.А. Иванов, С.С. Ветчинин, А.С. Шашков, С.В. Дентовская, Ю.А. Книрель, А.П. Анисимов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы–конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора (25–27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – Протвино: А–ПРИНТ ЗАО, 2010. – С. 274–276.
  2. Kondakova A.N. Structures of the O–polysaccharides of Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica and subsp. australis resembling that of Francisella tularensis / A.N. Kondakova, N.A. Kirsheva, A.S. Shahshkov, R.Z. Shaikhutdinova, S.A. Ivanov, A.P. Anisimov, Y.A. Knirel // Program and abstracts of the 4th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (September 19–22, 2010, Hyytil, Finland). – Hyytil, 2010. – P. 41.
  3. Киршева Н.А. Определение строения О–специфических полисахаридных цепей липополисахарида Photorhabdus asymbiotica subsp. asymbiotica и устойчивости Photorhabdus spp. к полимиксину В / Н.А. Киршева, А.Н. Кондакова, Р.З. Шайхутдинова, С.А. Иванов, Г.М. Титарева, А.С. Шашков, С.В. Дентовская, Ю.А. Книрель, А.П. Анисимов // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III научно–практической школы–конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора (31 мая –2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – Протвино: А–Принт ЗАО, 2011. – С. 191–193.
  4. Киршева Н.А. Экспериментальная фоторабдозная инфекция / Н.А. Киршева, Р.З. Шайхутдинова, Г.М. Титарева, С.В. Дентовская, А.П. Анисимов // Инфекционные болезни. – 2011. – № 9. – С. 166.
  5. Bakhteeva I.V. Structural studies on the lipopolysaccharide of Photorhabdus temperata subsp. temperata 3240 / I.V. Bakhteeva, G.M. Titareva, N.A. Kirsheva, A.N. Kondakova, A.S. Shashkov, Y.A. Knirel // Program and abstracts of the 5th Baltic Meeting on Microbial Carbohydrates (2–6 September 2012, Suzdal, Russia) – Suzdal, 2012. – P. 25.

Список сокращений, используемых в тексте

12:0 – лауроильная группа

14:0 – миристоильная группа

16:0 – пальмитоильная группа

в/б – внутрибрюшинно

ГЖХ – газожидкостная хроматография

ГКПМ–Оболенск – Государственная коллекция патогенных микроорганизмов и клеточных культур – Оболенск

ДСН – додецилсульфат натрия

ИОХ – Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского

КОЕ – колониеобразующая единица

ЛПС – липополисахарид

МПК – минимальная подавляющая концентрация

НЧС – нормальная (неиммунная) человеческая сыворотка

п/к – подкожно

РАН – Российская академия наук

тНЧС – термоинактивированная НЧС

ФБУН ГНЦ ПМБ – Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

ЯМР – ядерный магнитный резонанс

DDHep – DглицероDманногептоза

D–FucNAc4N – 2–ацетамидо–4–амино–2,4,6–тридезокси–D–галактоза

D–GalNAc – N–ацетил–D–галактозамин

DGalNAc4PEtN – 2–аминоэтилфосфатное производное N–ацетил–D–галактозамина

D–Qui3NFo – 3,6–дидезокси–3–формамидо–D–глюкоза

Gal – галактоза

GalA – галактуроновая кислота

GalNA – 2амино2–дезоксигалактуроновая кислота

GalNAcA – 2–ацетамидо–2–дезоксигалактуроновая кислота

Glc – глюкоза

GlcN – глюкозамин

GlcNAc – N–ацетилглюкозамин

Gly – глицин

Hep – L–глицеро–D–манно–гептоза

Hex – гексоза

Kdo – 3–дезокси–D–манно–окт–2–улозоновая (кетодезоксиоктоновая) кислота

LB среда – среда Luria–Bertani

LD50 – доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50)

Lys – лизин

Man – манноза

P – остаток ортофосфорной кислоты

PEtN – фосфоэтаноламин

PMB – полимиксин В

Qui

 


Похожие работы:

«Шрамко Павел Александрович РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ОБОЛЕНСК-2012 Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки Государственный...»

«Суфияров Ринат Сабитович КОМПЛЕКСНАЯ ПРОФИЛАКТИКА, ДИАГНОСТИКА И ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННЫХ ГНОЙНО- ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 14.01.17. – ХИРУРГИЯ 03.02.03- микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук УФА – 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального...»

«ЛАТКИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА РАСПРОСТРАНЕНИЕ ОТОДЕКТОЗА СОБАК И КОШЕК В СУРГУТСКОМ РАЙОНЕ ХАНТЫ-МАНСИЙСКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА И ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭТОЙ ИНВАЗИИ 03.00.19 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии и в условиях клиники Сургутской...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«Павлов Виталий Михайлович Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis 03.02.03– микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. НАУЧНЫЙ...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ МАРТ авторефераты 1. Александрова, Наталья Владимировна. Состояние системы мать-плацента-плод, течение и исходы беременности, наступившей с использованием вспомогательных репродуктивных технологий : автореферат диссертации. доктора медицинских наук : 14.01.01 / Н. В. Александрова ; конс.: О. Р. Баев, Г. Т. Сухих ; Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова (М.). - М. : б. и., 2013. - 46 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1).

«ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Ростов-на-Дону 2013 Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«Сабарайкина Светлана Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КРАСНЫХ СМОРОДИН ПОДРОДА RIBESIA L. В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2009 Работа выполнена в филиале Ботанический сад Института биологических проблем криолитозоны СО РАН. Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич кандидат...»

«ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭПИЗООТОЛОГИЯ ТРЕМАТОДОЗОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРОТИВОТРЕМАТОДОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РЕСПУБЛИКЕ АЛТАЙ Специальность 03.02.11 - Паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2010 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук Научный...»

«МАРКОВА Юлия Александровна ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ 03.02.03-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в ФГБУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования Министерства...»

«УДК 579.22.577.121 ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном...»

«Блохина Светлана Викторовна ЭПИЗО ОТО ЛОГИЯ ЦИСТНО ГО ЭХИНОКОККОЗ А В ОМСКОЙ О Б ЛАСТИ 03.00.19 - паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень - 2009 Работа выполнялась в ФГУ ВПО Омский государственный аграрный университет и в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«Неверов Алексей Дмитриевич КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ СПЛАЙСИНГА 03.00.03 - Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук - Москва 2007 – Работа выполнена в лаборатории биоинформатики Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ФГУП “ГосНИИ генетика”. Научный руководитель : доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук Миронов Андрей Александрович...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ Авторефераты Январь-2013 1. Аббасова, Самира Фуад кызы. Возможности видеоэндоскопического хирургического лечения хронического калькулезного холецистита у лиц пожилого возраста : автореферат диссертации. кандидата медицинских наук : 14.01.17 / С. Ф. Аббасова ; Российский университет дружбы народов (М.), кафедра госпитальной хирургии. - М. : б. и., 2013. - 19 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1). 2.

«МИНВАЛЕЕВ Ринад Султанович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ВНУТРИОРГАННОГО КРОВОТОКА ПРИ ИЗБРАННЫХ ПОЗАХ ЧЕЛОВЕКА (ПО ДАННЫМ ДОППЛЕРЭХОГРАФИИ) 03.00.13 - физиология человека и животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 1999...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«ШАРПАН Мария Владимировна МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРЯ 03.00.16 – Экология (физико-математические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук К раснодар 200 8 Работа выполнена на кафедре прикладной математики ГОУ ВПО К убанский государственный...»

«ЕЛИСТРАТОВА Людмила Леонтьевна КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АКНЕПОДОБНЫХ ДЕРМАТОЗОВ, ОСЛОЖНЕННЫХ ДЕМОДЕКОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Министерства здравоохранения...»







Загрузка...



 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.