WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Идентификация специфичных маркеров для характеристики множественно-устойчивых госпитальных штаммов enterobacteriaceae

На правах рукописи

ПРЯМЧУК

СЕРГЕЙ ДМИТРИЕВИЧ

идЕНТиФИкациЯ СПЕЦИФИЧНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ МНОЖЕСТВЕННО-устойчивЫХ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ENTEROBACTERIACEAE

03.02.03 микробиология

03.02.07 генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск 2011

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

кандидат биологических наук Фурсова Надежда Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Михайлова Наталья Александровна

доктор биологических наук Игнатов Сергей Георгиевич

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «26» декабря 2011 года в 13 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский район, п. Оболенск

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии».

Автореферат разослан «_25_» _ноября_2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами (Livermore, 2009). Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальбным препаратам и способы распространения генов МЛУ (Wright, 2010). Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер (Warren et al, 2008; Козлов, 2000).

Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков (Hawkey&Jones, 2009). Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно (Nikaido, 2009).

Быстрое определение видовой принадлежности возбудителей инфекций и их чувствительности к антибактериальным препаратам зачастую является вопросом жизни и смерти пациентов. Методы, используемые для этого в рутинной практике, варьируют в зависимости от оснащенности клинических лабораторий и подготовленности персонала - от микробиологических, в разной степени автоматизированных, до молекулярно-биологических. Наиболее перспективными с точки зрения быстроты и точности получаемого ответа являются разные варианты скрининга, основанного на амплификации ДНК с помощью специфичных праймеров, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), в стандартном режиме и в режиме реального времени (Fluit et al, 2001). Преимуществами данного метода являются быстрота, надежность и специфичность; недостатком – то, что выявлению подлежат только уже описанные ранее последовательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазмиды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний (Aminov, 2010).





Цель исследования - выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003-2007 гг.

Задачи исследования:

  1. Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (нозокомиальных) штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003-2007 гг.
  2. ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.
  3. Разработка алгоритма идентификации генов blaCTX-M, детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).
  4. Изучение генетического окружения генов blaCTX-M и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.
  5. Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.
  6. Создание перечня генетических маркеров антибиотикорезистентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.

Научная новизна. Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae - возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003-2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев (75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов blaCTX-M, позволяющий определить 49 генов из 96, а остальные 47 - в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов blaCTX-M подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последовательностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген blaCTXM116 и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены blaCTXM локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены blaCTXM, внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых – 3.


Практическая значимость. Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерий – возбудителей нозокомиальных инфекций (n=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (n=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотикоустойчивости (n=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003-2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов blaCTX-M, детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 – «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Госпитальные штаммы энтеробактерий, выделенные в различных регионах РФ в 2003-2007 гг., в большом проценте случаев являются носителями генов резистентности к антимикробным препаратам различных функциональных групп одновременно, что определяет их множественную устойчивость.
  2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз TEM, SHV, OXA, AmpC и CTX-M типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.
  3. Гены blaCTX-M – превалирующие детерминанты устойчивости к бета-лактамам (77 % штаммов) - локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcp1, IS26, IS903, orf513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.
  4. Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены blaCTXM до индивидуального гена (51 %) или в составе небольших подгрупп (49 %).
  5. В геноме нозокомиального штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген blaCTXM116 (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749; учетный номер в специализированной базе данных Lahey – «CTX-M-116»), кодирующий ранее не описанный фермент CTX-M-типа, имеющий гибридную природу.
  6. Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование антибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38 %) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003-2007 гг.
  7. Устойчивости к хинолонам у 23 % штаммов Enterobacter spp. определяется наличием плазмидных генов qnr, сравнительно новым молекулярным механизмом устойчивости к данному классу препаратов.
  8. Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в клиниках РФ.

Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутрибольничных и пищевых инфекций» (2006-2010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61

«Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005-2007).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н.К., к.м.н. Абаевым И.В., к.б.н. Кругловым А.Н., н.с. Печерских Э.И., к.б.н. Коробовой О.В., к.б.н. Шишковой Н.А., к.м.н. Анисимовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю.Н., к.м.н. Асташкиным Е.И., к.б.н. Пачкуновым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э.А., д.м.н., проф. Сидоренко С.В. и д.м.н., проф. Дятловым И.А.

Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1-4, 2006; VII Международный Конгресс МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии. 30 мая – 1 июня 2006 г., Москва; The 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24-30, 2006; The 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27-30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., Россия; The 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс МАКМАХ/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая – 1 июня 2007 г.; The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17-20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г.; Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18–19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.; X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009; The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.; Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г.; XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18-20 мая 2011.





Публикации. Основное содержание работы отражено в 22 публикациях, в том числе в трех научных работах, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований, выводы и указатель литературы, включающий 145 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 46 рисунками и 20 таблицами.

Содержание работы


Материалы и методы исследования

Две коллекции независимо полученных нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae собраны в 2003-2004 гг. (n=489) из разнопрофильных стационаров 15 городов РФ: Владивосток (n=15), Воронеж (n=12), Екатеринбург (n=14), Иркутск (n=80), Казань (n=7), Краснодар (n=37), Магнитогорск (n=3), Москва (n=91), Омск (n=48), Ростов-на-Дону (n=7), Санкт-Петербург (n=70), Саратов (n=22), Томск (n=28), Уфа (n=6) и Ярославль (n=49) (рис. 1); а также в 2005-2007 гг. (n=434) из 12 разнопрофильных клиник Московской медицинской академии (ММА) им. И.М. Сеченова: общей хирургии, гнойной хирургии, кардиохирургии, урологии, гинекологии, челюстно-лицевой хирургии, отделения патологии новорожденных, ЛОР, нефрологии, отделений интенсивной терапии терапевтических клиник (рис. 1).

Рисунок 1 – Карта Российской Федерации, на которой представлено количество госпитальных штаммов, выделенных в различных городах в 2003-2007 гг.

Видовую принадлежность изолятов проводили с помощью идентификационной системы BBL Crystal™ E/NF (Becton, Dickinson, США) и коммерческих панелей в автоматической системе идентификации MicroScan (DadeBehring, США). Штаммы микроорганизмов отобраны в коллекцию в соответствии со следующими критериями: 1) устойчивость к одному или нескольким цефалоспоринам III-IV поколений; 2) положительный тест на наличие бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС). Бактериальные культуры хранили в 20 %-ном глицерине при -70 C.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибиотиков азтреонама, амикацина, ампициллина, ампициллин-сульбактама, гентамицина, доксициклина, имипенема, ко-тримоксазола, меропенема, хлорамфеникола, цефепима, цефоперазона, цефоперазон-сульбактама, цефуроксима, цефокситина, цефотаксима, цефтазидима, цефтазидим-клавуланата и ципрофлоксацина (Merck, США) определяли в соответствии с указаниями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (CCLS/CLSI. 2006), рекомендациями European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (ttp://www.eucast.org) и с методическими указаниями Роспотребнадзора РФ (Методические указания, 2004). В качестве внутренних стандартов использовали чувствительный штамм E. coli ATCC 25922 и высокоустойчивый штамм E. coli  ATCC 35218.

Определение генов устойчивости, а также IS-элементов, транспозонов и интегронов проводили с помощью специфических праймеров. В качестве матрицы ДНК использовали кипяченые лизаты. Амплификацию ДНК проводили в 25 мкл смеси, содержащей 75 mM Tris-HCl (pH 8.8), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% Tween 20, 1,5 mM MgCl2, 200 µM каждого dNTPs, 0,5 µM каждого праймера, 0,7 единиц активности Taq-полимеразы (Fermentas, Литва), и 2 мкл матричной ДНК. Амплификацию проводили в приборе GradientPalmCycler (Corbert Research, Австралия) в следующих условиях: начальная денатурация при 95 C в течение 2 мин; последующие 30 циклов: денатурация при 95 C в течение 30 с; отжиг при 51-60 C, в зависимости от используемых праймеров, элонгация при 72 C в течение 30 с-2 мин, в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента, заключительная элонгация при 72 C в течение 10 мин. Визуализацию ПЦР-продуктов проводили с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле на оборудовании Sub-Cell GT (BioRad, США), окрашивания раствором бромистого этидия и фотографирования на приборе Gel Doc XR System 170-8170 (Bio-RAD, США) в УФ свете с длиной волны 254 нм.

Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) ПЦР-продуктов осуществляли с использованием 26 рестрикционных эндонуклеаз AluI, AvaII, BbvI, BsaHI, BsrBI, BsrDI, Bsp1286I, BstXI, CviJI, DdeI, EcoRII, HinfI, HphI, Hpy99I, Hpy188I, Hpy188III, Ksp632I, MaeII, McrI, MspA1I, MstI, MwoI, PleI, SfcI, SimI, Sth132I (Fermentas, Литва).

Секвенирование последовательностей ДНК проводили на оборудовании ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant (Applied Biosystems, США).

Конъюгативный перенос плазмид из клинических изолятов осуществляли с использованием реципиентного лабораторного штамма E. coli C600 (RifRAzR) (Прямчук и др., 2010).

ДНК плазмид выделяли по методу Kado & Liu. (1981). Плазмидные профили штаммов изучали, используя в качестве маркера ДНК плазмид, выделенных из штамма E. coli K12 NCTC 50192 (148, 64, 36, 23 и 7 т.п.н).

Гибридизацию ДНК-ДНК осуществляли с помощью высокочувствительного набора реактивов AlkPhos Direct Labeling и детектирующей системы CDP-Star в соответствии с рекомендациями производителя (Amersham, США). ДНК-зонды готовили из ПЦР-продуктов, амплифицированных с генов blaCTX-M и генов intlI интеграз 1 класса.

Группы несовместимости (Inc) плазмид идентифицировали методом ПЦР-типирования по Carattoli A. (2005).

Биоинформатический анализ последовательностей нуклеотидов генов и их рестрикционных карт проводили с помощью программного обеспечения Vector NTI9 (Invitrogen Corporation, США). Последовательности ДНК сравнивали с представленными в базе данных GenBank с помощью программы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast).

Учетные номера последовательностей ДНК, секвенированных в ходе данной работы и размещенных в базе данных GenBank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ), представлены в табл. 1.

Результаты исследований и их обсуждение

Сравнение нозокомиальных изолятов семейства

Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг.

Анализ видовой принадлежности клинических изолятов, выделенных в РФ в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг., показал, что в данных коллекциях преобладали Escherichia coli (34 % и 30 % соответственно), Klebsiella spp. (27 % и 35 %) и Enterobacter spp. (16 % и 22 %). Другие виды энтеробактерий в сумме составляли 23 % и 13 % соответственно. Наиболее часто источниками выделения изолятов в 2003-2004 гг. были: моча, органы дыхания и хирургические раны, а в 2005-2007 гг. - моча, хирургические раны и ЖКТ. При этом основными источниками выделения изолятов E. coli были моча (49 %), органы дыхания (18 %) и хирургические раны (17 %); изоляты Klebsiella spp. преимущественно выделялись из мочи (38 %), органов дыхания (19 %), хирургических ран (14 %) и желчи (11 %), а изоляты Enterobacter spp. – из мочи (40 %), органов дыхания (18 %), хирургических ран (18 %), желчи (5 %) и внешней среды (5 %).

Анализ уровней устойчивости изолятов к цефалоспоринам III-IV поколений с учетом пограничных концентраций цефотаксима (МПК2 мг/л), цефтазидима (МПК8 мг/л) и цефепима (МПК8 мг/л), опубликованных на сайте EUCAST (http://www.eucast.org/) в 2010 г., показал, что к цефотаксиму устойчивы 100 % E. coli, 100 % Klebsiella spp. и >92 % Enterobacter spp.; к цефтазидиму – >70 % изолятов всех трех видов энтеробактерий; а к цефепиму – около 75 % E. coli и Klebsiella spp. и >50 % Enterobacter spp. Многие изоляты проявляли устойчивость к двум и даже трем цефалоспоринам одновременно. Доля именно таких изолятов значительно увеличилась за данный период времени (рис. 2).

Значительная часть изучаемых изолятов проявляла ассоциативную устойчивость к антимикробным препаратам других функциональных классов (не бета-лактамам): гентамицину, амикацину, ципрофлоксацину, ко-тримоксазолу и хлорамфениколу. Сравнение фенотипов E. coli, выделенных в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг., показало, что доля изолятов, устойчивых к ципрофлоксацину (МПК4 мг/л) и ко-тримоксазолу (МПК4 мг/л), в обеих коллекциях одинакова, а изолятов, устойчивых к гентамицину (МПК16 мг/л), амикацину (МПК64 мг/л) и хлорамфениколу (МПК32 мг/л), - несколько выше в первой коллекции (рис. 3А). Но при этом доля изолятов, высокоустойчивых (МПК256 мг/л) к гентамицину и ципрофлоксацину, напротив, во второй коллекции выше, чем в первой (рис. 3Б).

Сравнение фенотипов Klebsiella spp. показало, что доли устойчивых изолятов несколько выше в первой коллекции, чем во второй: к гентамицину, амикацину и ко-тримоксазолу, но ниже к ципрофлоксацину, и одинаковы - к хлорамфениколу. Доли изолятов Klebsiella spp., высокоустойчивых (МПК256 мг/л) к хлорамфениколу и к ципрофлоксацину, в первой коллекции ниже, чем во второй.

Рисунок 2 – Доля клинических изолятов E. coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых (МПК2/8/8 мг/л) и высокоустойчивых (МПК256 мг/л) к цефотаксиму (CTX), цефтазидиму (CAZ) и цефепиму (CEP), среди изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. и в 2005-2007 гг. CTX* - включая CTX+CAZ, CTX+CEP и CTX+CAZ+CEP; CAZ* - включая CTX+CAZ, CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP; CEP* - включая CTX+CEP, CAZ+CEP и CTX+CAZ+CEP.

Доли изолятов Enterobacter spp., устойчивых к ряду антибиотиков, во второй коллекции выше, чем в первой: к гентамицину, амикацину и ципрофлоксацину, в то время как для других антибиотиков (хлорамфениколу и ко-тримоксазолу) соотношение обратное. Доля высокоустойчивых изолятов Enterobacter spp. с МПК256 мг/л в первой коллекции ниже, чем во второй, для всех маркеров ассоциативной устойчивости, кроме хлорамфеникола. Таким образом, для E. coli и Klebsiella spp. отмечена тенденция к снижению ассоциативной устойчивости, а для Enterobacter spp. к ее повышению. Аналогично, доля изолятов, одновременно устойчивых к трем классам антибиотиков – цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину - (МЛУ3), а также к пяти классам антибиотиков - цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу и ко-тримоксазолу - (МЛУ5), уменьшилась для E. coli и Klebsiella spp.,но увеличилась для Enterobacter spp (рис. 2).

Рисунок 3 – Доля клинических изолятов E. coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., устойчивых и высокоустойчивых к гентамицину (GEN), амикацину (AMI) ципрофлоксацину (CIP), хлорамфениколу (CM) и ко-тримоксазолу (CTZ). МЛУ-3* - устойчивость к трем классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину и ципрофлоксацину); МЛУ-5* - устойчивость к пяти классам антибиотиков (цефалоспоринам, амикацину, ципрофлоксацину, хлорамфениколу и ко-тримоксазолу).

Таким образом, анализ видового состава и источников выделения возбудителей нозокомиальных инфекций, а также фенотипов устойчивости данных бактерий к антибактериальным препаратам, используемым в клиниках РФ, указывает на широкое распространение в госпитальных сообществах штаммов, устойчивых к бета-лактамам и антибиотикам других функциональных групп.

ПЦР-детекция генов антибиотикоустойчивости

Методом ПЦР в геномах изучаемых клинических изолятов показано наличие генов бета-лактамаз, принадлежащих к разным типам ферментов: TEM, SHV, CTXM, OXA и AmpC (табл. 2). Наибольшее распространение получили гены blaCTX-M, присутствующие в 90 % изолятов E. coli и Klebsiella spp., а также в 40 % Enterobacter spp.

Некоторые изоляты несут по одному из тестируемых генов бета-лактамаз, но большинство - 68% E. coli, 83 % Klebsiella spp. и 44 % Enterobacter spp. - имеют одновременно два или три гена в разных сочетаниях. Стоит отметить, что ранее, в работе Сидоренко С.В. с соавт. (2004) сообщалось, что в России доля штаммов, имеющих не один, а несколько генов БЛРС разных типов, составляла 40 %, таким образом произошло существенное увеличение данного показателя. Самыми распространенными комбинациями генов в изученных нами клинических изолятах оказались blaTEM+blaCTX-M для E. coli (51 %) и blaSHV+blaCTX-M - для Klebsiella spp. (39 %), что также значительно превышает аналогичные оценки в исследовании Сидоренко С.В. с соавт. (2004). Именно в данной категории изолятов выявлены два изолята, продуцирующие дополнительно оксациллиназу OXA-2. Наиболее распространенными комбинациями генов для Enterobacter spp. были blaTEM (14 %) и blaTEM+blaCTX-M (13 %).

Таблица 2 – Гены бета-лактамаз в геномах энтеробактерий,

выделенных в 2003-2007 гг.

Гены bla, кодирующие бета-лактамазы Количество изолятов, шт. (%)
E. coli Klebsiella spp. Enterobacter spp.
2003-2004 n=133 2005-2007 n=126 2003-2004 n=131 2005-2007 n=146 2003-2004 n=77 2005-2007 n=97
TEM 5 (4) 3 (2) 1 (1) 1 (1) 12 (16) 22 (23)
SHV 0 1 (1) 5 (4) 2 (1) 6 (8) 3 (3)
CTXM 35 (26) 42 (33) 14 (11) 16 (11) 7 (9) 5 (5)
TEM+SHV 9 (7) 0 9 (7) 7 (5) 10 (13) 11 (11)
TEM+CTXM 70 (53) 63 (50)х 10 (8) 2 (1) 20 (26) 13 (13)
SHV+CTXM 8 (6) 3 (2) 44 (34) 65 (45) х 2 (3) 5 (5)
TEM+SHV+CTXM 11 (8) 11 (9) 43 (33) 50 (34) 2 (3) 14 (14)
Нет генов 6 (5) 3 (2) 0 3 (2) 20 (26) 24 (25)
Всего TEM 84 (63) 77 (61) 66 (50) 60 (41)
44 (57) 60 (62)
Всего SHV 28 (21) 15 (12) 104 (79) 124 (85) 18 (23) 33 (34)
Всего CTXM 113 (85) 119 (94) 114 (87) 133 (91) 29 (38) 37 (38)
Всего AmpC 0 0 13 0 0 13
DHA 0 0 11 0 0 0
MIR 0 0 2 0 0 11
MOX 0 0 0 0 0 1
LAT 0 0 0 0 0 1

Интересно отметить, что 26 изолятов (6 %) в первой коллекции и 30 изолятов (7 %) второй коллекции, большинство из которых являлись Enterobacter spp., не имели ни одного из тестируемых генов бета-лактамаз. Очевидно, что устойчивость данных микроорганизмов к бета-лактамам обеспечивается какими-то другими молекулярными механизмами, чем наличие бета-лактамаз. По литературным данным, это могут быть эффлюксные системы, снижение проницаемости мембран за счет мутаций в генах пориновых белков или наличие индуцибельных ферментов AmpC-типа (Fernndez-Cuenca F., 2006).

Таким образом, с помощью ПЦР-детекции генов показано, что основным молекулярным механизмом устойчивости к цефалоспоринам III-IV поколений у изучаемых штаммов энтеробактерий является наличие генов бета-лактамаз CTXM-типа.

Разработка алгоритма идентификации генов blaCTX-M

Для идентификации генов, кодирующих ферменты цефалоспориназ CTXM, разработан двухэтапный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа, включающий в себя (1) определение кластера гена с помощью рестриктазы AluI и (2) идентификацию гена внутри кластера с помощью набора из 26 рестриктаз. Метод позволяет определить 49 генов из 96, размещенных к настоящему времени в базе данных GenBank. Остальные 47 генов определяются в составе небольших подгрупп.

Разработанный алгоритм идентификации генов blaCTX-M использован в ходе молекулярно-эпидемиологического мониторинга генов blaCTX-M в нозокомиальных изолятах, выделенных в РФ в 2003-2007 гг. Показано, что идентифицированные гены blaCTX-M (n=585) вносят решающий вклад в формирование бактериальных фенотипов устойчивости к цефалоспоринам, они присутствовали в геномах 66 % изолятов (рис. 4).

Идентификация нового гена blaCTXM116

В геноме нозокомиального штамма Proteus mirbilis, выделенного в Москве в 2005 г. от пациента отделения урологии ММА им. И.М. Сеченова, идентифицирован ген blaCTXM116, кодирующий ранее не описанный фермент CTX-M-типа. Данный ген идентифицирован методом ПЦР-ПДРФ с последующим секвенированием, в результате которого было установлено, что он является гибридом между двумя известными ранее генами: blaCTXM23 и blaCTXM22. Нуклеотидная последовательность гена, вместе с расположенной рядом последовательностью мобильного генетического элемента ISEcp1, размещена в международной базе данных GenBank (учетный номер JF966749). Ген blaCTXM116 включен в специализированную базу данных по ферментам бета-лактамазам Lahey ( http://www.lahey.org/Studies/other.asp ).

Изучение генетического окружения генов blaCTX-M

Анализ генетического окружения генов blaCTXM показал, что для большинства генов (blaCTXM3, blaCTXM14 и blaCTXM15) характерно наличие рядом с геном последовательности мобильного генетического элемента (МГЭ) ISEcp1. Характерно, что данный МГЭ располагается «выше» гена бета-лактамазы на расстоянии, характерном для индивидуальных генов: 48 п.н. для blaCTXM15 - (кроме одного изолята E. coli, у которого данная последовательность равна 45 п.н.); 127 п.н. для blaCTXM3; 42 п.н для blaCTXM14. В некоторых изолятах элемент ISEcp1 имеет стандартную структуру, но во многих содержит делеции различной протяженности, а также инсерции других МГЭ в разных ориентациях: IS26, IS1, IS10 и resTn3. «Ниже» генов кластера blaCTXM1 в подавляющем числе изолятов локализована структура orf477mucA, причем для гена blaCTXM3 их нуклеотидные последовательности в большинстве изолятов не нарушены, а для гена blaCTXM15 характерны укороченные варианты - orf477mucA. В двух изолятах E. coli «ниже» гена blaCTXM15 идентифицирована последовательность, имеющая дополнительную вставку: orf477orf3mucA. «Ниже» генов, кодирующих ферменты CTXM14, локализована последовательность элемента IS903, в полноразмерном или укороченном виде (рис. 5).

Рисунок 4 - Результаты идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы CTX-M-типа, в нозокомиальных изолятах бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в 2003-2007 гг. В скобках после родового или видового названия бактерий указано количество изолятов

Генетическое окружение генов blaCTXM2 и blaCTXM9 принципиально отличается от описанного выше, т.к. названные гены локализованы в структуре ISCR1 элемента, «ниже» интегрона класса 1 и последовательности МГЭ orf513.

Выявленное разнообразие генетического окружения генов, кодирующих БЛРС CTXM-типа в российских клинических изолятах, не противоречит схемам, описанным ранее другими исследователями (Eckert C., et al., 2006), но добавляет новые, ранее не описанные варианты, возникающие в результате рекомбинации и горизонтального переноса.

Таким образом, полученные нами данные показывают наличие большого генетического разнообразия в участках геномов бактерий семейства Enterobacteriaceae, прилегающих к генам blaCTXM, определяющим высокие уровни устойчивости к цефалоспоринам III-IV поколений. Данное разнообразие, во всей видимости, является отражением эволюционных процессов, проходящих на фоне селективного давления широко применяемых лекарственных средств для лечения инфекционных осложнений в стационарах РФ.

Идентификация генов резистентности, локализованных в интегронах


С помощью ПЦР показано, что изучаемые клинические изоляты имеют детерминанты устойчивости не только к бета-лактамам, но и к аминогликозидам (гены аденилилтрансфераз aadA1, aadA2, aadA5, aadB; аминогликозидацетилтрансфераз aacA4, aac(6')-Ib); сульфаниламидам (гены дигидрофолатредуктаз dfrA1, dfrA5, dfrA12, dfrA17), хлорамфениколу (ген протонного эффлюксного насоса cmlA1 и хлорамфениколацетилтрансферазы catB8), эритромицину (ген эритромицинэстеразы ereA2) и стрептотрицину (ген стрептотрицинацетилазы sat1) – в виде генетических кассет в составе интегронных вставок (рис. 6).

Изучение конъюгативных плазмид, несущих гены устойчивости


Конъюгативный перенос генов blaCTX-M из клеток изучаемых клинических штаммов энтеробактерий в лабораторный реципиентный штамм E. coli C600 (RifRAzR) был успешно осуществлен для 23 % E. coli, 27 % Klebsiella spp., 12 % Enterobacter spp. и 44 % Citrobacter spp. с эффективностью 103-107. Отмечено, что перенос генов кластера blaCTX-M-1 в большинстве случаев происходил на одном репликоне с генами blaTEM. Напротив, перенос генов кластера blaCTX-M-9 чаще всего происходил отдельно от генов blaTEM. Экспрессия передаваемых конъюгацией генов blaCTXM (оцениваемая по МПК трех антибиотиков: цефотаксима, цефтазидима, цефепима) различалась в донорном и реципиентном штаммах. Это выражалось в увеличении МПК в несколько раз (от 4 мг/л до 256 мг/л) цефтазидима (n=17); а также в изменении МПК цефепима - как в сторону снижения (n=6), так и в сторону увеличения (n=6).


Рисунок 5 – Генетическое окружение генов blaСТХ-М

Рисунок 6 - Структура интегронных вставок класса 1 (А) и класса 2 (Б)

Сравнение плазмидных профилей доноров и трансконъюгантов показало, что клинические изоляты содержали от одной до двенадцати плазмид различной молекулярной массы (наибольшее количество плазмид отмечено в некоторых изолятах K. pneumoniae), а в клетках трансконъюгантов в подавляющем большинстве случаев определялась только одна, высокомолекулярная плазмида размером 60-160 т.п.н. С целью типирования конъюгативных плазмид плазмидную ДНК гидролизовали рестриктазами BamHI и EcoRI. Определено не менее 10 вариантов плазмид, что хорошо коррелировало с данными ПЦР-анализа на наличие генов интеграз и бета-лактамаз. На основании различий в молекулярных массах, плазмиды были подразделены на несколько групп (A, B, C, D, E, F, G), а с помощью последующего рестрикционного анализа эндонуклеазами BamHI и EcoRI - на подгруппы (A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7; В1, В2; C1, C2; D1, D2)

С помощью Саузерн-гибридизации со специфичным ДНК-зондом показано, что в большинстве клинических изолятов гены blaCTXM и интегроны класса 1 локализованы на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.). На описанных конъюгативных плазмидах локализованы также гены, кодирующие бета-лактамазы ТЕМ-типа (13 % изолятов).

ПЦР-типирование плазмид по группам несовместимости Inc показало, что конъюгативные плазмиды, присутствующие в клинических изолятах E. coli, преимущественно принадлежат к группам несовместимости IncF, IncA/C и IncI1-ly; в изолятах Klebsiella spp. – к IncL/M и IncF, а в изолятах Enterobacter spp. - к IncFIB, IncL/M и IncA/C (рис 7).

Многие конъюгативные плазмиды (38 %) имели гибридную природу, т.е. показывали принадлежность к двум-четырем разным группам несовместимости. Показано, что группы несовместимости плазмид достаточно специфичны для разных аллотипов гена blaCTXM: ген blaCTXM15 чаще ассоциирован с плазмидами групп несовместимости IncF, IncL/M и IncA/C; ген blaCTXM3 – с плазмидами IncL/M; а ген blaCTXM14 – с плазмидами IncF, IncI1-ly и IncA/C.

Рисунок 7 - Inc группы конъюгативных плазмид разных видов энтеробактерий (А); Inc группы плазмид, на которых локализованы гены blaCTXM (Б)

Таким образом, полученные нами данные показывают, что гены резистентности к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов в нозокомиальных штаммах энтеробактерий локализованы на конъюгативных плазмидах, что обеспечивает их горизонтальное распространение между бактериями. Нами подтверждается отмеченная ранее другими авторами важная роль конъюгативных плазмид в распространении генов лекарственной устойчивости.

Заключение

Представители семейства Enterobacteriaceae играют важнейшую роль в этиологии госпитальных инфекций – они составляют около 20 % среди общего количества возбудителей. В данном исследовании проведено сравнительное изучение изолятов, выделенных в 2003-2004 гг. из крупных городов РФ, и в 2005-2007 гг. – из клиник ММА им. И.М. Сеченова. Показано, что штаммы обеих коллекций устойчивы к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхинолонам и сульфаниламидам. Большая часть коллекции (89 %) представлена штаммами, одновременно устойчивыми к трем и более классам антибактериальных препаратов. Показано, что геномы штаммов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам, содержат от одного до трех генов различных бета-лактамаз. Наиболее распространенным геном является ген blaCTXM15, принадлежащий к кластеру blaCTXM1. Генетическое окружение генов, кодирующих бета-лактамазы CTXM типа, включает в себя мобильные генетические элементы, набор которых характерен для индивидуальных генов и вида микроорганизма. Показана значительная вариабельность данных последовательностей, что указывает на бурные эволюционные процессы, проходящие в данных участках генома. Подтверждением данного тезиса явилось открытие нового гена blaCTXM116, который представляет собой гибрид между генами blaCTXM23 и blaCTXM22, и содержит в середине последовательности core-сайт, в области которого, предположительно, произошла рекомбинация. Показано, что гены blaCTXM локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах, имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена. В ходе работы разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов blaCTXM, позволяющий идентифицировать около половины генов до индивидуального гена, а остальные - в составе небольших подгрупп.

Установлено, что устойчивость штаммов к антибиотикам других функциональных классов (не бета-лактамам) в большой степени определяется наличием интегронов классов 1 и 2, которые присутствуют в геномах 38 % изученных штаммов. Интегроны несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и стрептотрицину. Кроме того, в геномах 23 % энтеробактеров обнаружены детерминанты нового механизма устойчивости к хинолонам – плазмидно-кодируемых генов qnr.

На основании проведенных исследований создан перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности в штаммах энтеробактерий, включающий 48 позиций: 13 - к бета-лактамам, 7 - к аминогликозидам, 3 - к хинолонам, 5 - к сульфаниламидам, 4 - к другим антибактериальным препаратам.

Выводы

  1. Создана и охарактеризована коллекция госпитальных штаммов (n=923) семейства Enterobacteriaceae, выделенных в РФ в 2003-2007 гг., в которой 99 % устойчивы к бета-лактамным антибиотикам, 83 % - к аминогликозидам, 91 % - к фторхинолонам, 72 % - к сульфаниламидам. Большая часть коллекции представлена штаммами, одновременно устойчивыми к нескольким классам антибактериальных препаратов: к двум – 8 %, к трем - 14 %, к четырем - 25 %, к пяти - 36 % и к шести – 13 %.
  2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам (пенициллинам и цефалоспоринам) определяется наличием генов бета-лактамаз TEM, SHV, OXA, AmpC и CTX-M типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49 % изолятов) или три (18 % изолятов) гена в разных сочетаниях.
  3. Наиболее распространенными в изученной коллекции генами бета-лактамаз являются гены blaCTX-M (77 % изолятов), генетическое окружение которых характерно для индивидуальных генов и демонстрирует большую вариабельность. Данные гены локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена.
  4. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов blaCTXM, позволяющий идентифицировать 49 генов до индивидуального гена и 47 генов определить в составе небольших подгрупп.
  5. Идентифицирован новый ген blaCTXM116 и размещен в базах данных GenBank и Lahey.
  6. Интегроны классов 1 и 2 присутствуют в геномах 38 % изученных штаммов; они несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам (aacA4, aac(6')Ib, aadA1, aadA2, aadB), хлорамфениколу (catB8, cmlA1), эритромицину (ereA2), сульфаниламидам (dfrA1, dfrA5, dfrA12, dfrA17 и sul1), стрептотрицину (sat1) и бета-лактамам (blaOXA-30).
  7. В геномах 23 % штаммов Enterobacter spp. зафиксировано появление сравнительно нового механизма устойчивости к хинолонам – плазмидно-кодируемых генов qnrB2, qnrB4 и qnrS.
  8. Предложен перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции в геномах множественно устойчивых штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в госпитальных сообществах РФ, включающий в себя 48 позиций, в том числе маркеры устойчивости к бета-лактамам (13), аминогликозидам (7), сульфаниламидам (5), хинолонам (3) и другим антибактериальным препаратам (4), а также структуры мобильных генетических элементов.

Таблица 1 - Учетные номера последовательностей ДНК в базе данных GenBank

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

    1. Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК
  1. Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Иванов Д.В., Сидоренко С.В., Светоч Э.А., Дятлов И.А. Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным средствам в нозокомиальных штаммах Escherichia coli, Klebsiella spp. и Enterobacter spp., выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиот. химиотер. – 2010. – Т. 55, №9-10. – С. 310.
  2. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Светоч Э.А., Сидоренко С.В. Генетическое окружение генов blaCTX-M, локализованных на конъюгативных плазмидах нозокомиальных изолятов Enterobacteriaceae, выделенных в России в 2003-2007 гг. // Антибиот. химиотер. – 2010. – Т. 55, №11-12. – С. 310.
  3. Прямчук С.Д., Фурсова Н.К., Анисимова В.А., Ковалев Ю.Н., Абаев И.В., Кужельная Е.Н., Светоч Э.А. Алгоритм идентификации генов, кодирующих бета-лактамазы CTX-M-типа, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта. // Молекуляpная генетика, микpобиология и виpусология. – 2011. – № 4 С. 7-13.

б) Тезисы научных конференций:

4. Fursova N.K., Kruglov A.N., Abaev I.V., Kovalev Y.N., Pecherskikh E.I., Astashkin E.I., Pachkunov D.M., Pryamchuk S.D., Anisimova V.A., Mitzevich M.E. Spreading of beta-lactamase genes among nosocomial isolates collected from Moscow clinics. //Clin. Microbiol. Infect. – 2006. – V. 12(4). – P. 1351.

5. Фурсова Н.К., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Печерских Э.И., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Прямчук С.Д., Круглов А.Н. Распространенность генов бета-лактамаз в клиниках Московской медицинской академии. //Материалы VII Международ. Конгресса МАКМАХ/ASM по антимикробной терапии. 30 мая – 1 июня 2006 г., Москва. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. 2006. – Т. 8. - С. 40.

6. Fursova N.K., Abaev I.V., Kovalev Y.N., Pecherskikh E.I., Astashkin E.I., Pachkunov D.M., Pryamchuk S.D., Morosova O.A., Kruglov A.N., Weigel L.M., Rasheed J.K. TEM, SHV, and CTX-M>

7. Abaev I., Fursova N., Pecherskikh E., Pryamchuk S., Korobova O., Shishkova N., Kovalev Y., Kruglov A., Ivanov D., Sidorenko S. Correlations Between Spreading of CTX-M-2 and CTX-M-9 Genes and>

8. Фурсова Н.К., Абаев И.В., Печерских Э.И., Прямчук С.Д., Коробова О.В., Шишкова Н.А., Ковалев Ю.Н., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Дронов И.А., Морозова О.А., Иванов Д.В., Сидоренко С.В. Распределение генов бета-лактамаз расширенного спектра среди нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae. // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 3-5 октября 2006 г., Оболенск. - С. 72-74.

9. Fursova N., I. Abaev, O. Korobova, E. Pecherskikh, N. Shishkova, S. Pryamchuk, A. Kruglov, D. Ivanov, L. Weigel, J. Rasheed. Comparative Study for Conjugative Plasmids Carrying CTX-M Genes in Escherichia coli Nosocomial Isolates. //Poster # P585 on the 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007.

10. Фурсова Н.К., Абаев И.В., Коробова О.В., Печерских Э.И., Шишкова Н.А., Прямчук С.Д., Круглов А.Н., Иванов Д.В., Вейгел Л., Рашид Дж. К. Разнообразие конъюгативных плазмид, несущих гены blaCTX-M-1, в нозокомиальных изолятах энтеробактерий //Материалы IX Международного конгресса МАКМАХ/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая – 1 июня 2007 г. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. - №81. - С. 42.

11. Fursova N., Abaev I., Pecherskikh E., Pryamchuk S., Korobova O., Shishkova N., Kruglov A., Ivanov D., Weigel L., Rasheed J.. Analysis of Gene Cassettes on>

12. Прямчук С.Д., Абаев И.В., Коробова О.В., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Фурсова Н.К. Детекция генетических структур в составе вариабельных участков интегронов класса 1, локализованных на плазмидах нозокомиальных штаммов Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae.// Тезисы конференции «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28-30 ноября 2007 г. - Т. 2. - С. 400-401.

13. Шишкова Н.А., Абаев И.В., Коробова О.В., Прямчук С.Д., Печерских Э.И., Фурсова Н.К. Идентификация групп несовместимости конъюгативных плазмид, несущих гены бета-лактамаз расширенного спектра CTX-M типа, в нозокомиальных штаммах Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae. // Материалы Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18–19 апреля 2008 г. Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - №2(22). - Ч. 1. - С. 198-199.

14. Fursova N., I. Abaev, Pryamchuk S., Shishkova N., Pecherskikh E., Korobova O., Kruglov A., Weigel L., Rasheed J.. Variability of Inc group of Conjugative Plasmids and CTX-M Gene Environments in Enterobacteriaceae Nosocomial Strains Isolated from Russia. //Materials of the 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19-22, 2008. – Clin. Microbiol. Infect. – 2008. - V. 15. - P. 38-39.

15. Фурсова Н.К., Абаев И.В., Прямчук С.Д., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Круглов А.Н., L.M. Weigel, J. K. Rasheed. Изучение механизмов распространения генов устойчивости к бета-лактамам среди нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae: группы несовместимости конъюгативных плазмид и генетическое окружение генов бета-лактамаз CTX-M типа. //Тезисы I Оболенской школы-конференции молодых ученых. 22-23 апреля 2008 г.

16. Фурсова Н.К., Шишкова Н.А., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Печерских Э.И., Круглов А.Н., Морозова О.А., L. Weigel, J. K. Rasheed. Обнаружение плазмидных детерминант устойчивости к хинолонам qnrB и qnrS в нозокомиальных штаммах Enterobacteriaceae. // Материалы X Международного конгресса МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21-23 мая 2008. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер. – 2008. - T. 10. - №2. - С. 43.

17. Fursova N., S. Pryamchuk, I. Abaev, N. Shishkova, E. Pecherskikh, A. Kruglov, S. Sidorenko, E. Svetoch, L. Weigel, J. Rasheed. Diversity of CTX-M Gene Environments in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Nosocomial Strains Isolated from Russia. //Poster # P1199 on the 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16-19, 2009. - Clin. Microbiol. Infect. – 2009. V. - 15(4). - P. 327.

18. Fursova N.K., Pryamchuk S., Abaev I., Kovalev Y.N., Shishkova N., Korobova O., Pecherskikh E., Astashkin Е.I., Pachkunov D.М., A. Kruglov, S. Sidorenko, Svetoch E., Weigel L.M., Rasheed J.K.. Prevalent Mechanisms of Multidrug Resistance in Enterobacteriaceae Nosocomial Strains: Genes, Cassettes, Plasmids. //Materials of the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21-25, 2009. -P. 48-49.

19. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Абаев И.В., Ковалев Ю.Н., Шишкова Н.А., Печерских Э.И., Коробова О.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Круглов А.Н., Светоч Э.А., Дятлов И.А. Вклад интегронов классов 1 и 2 в формирование множественной устойчивости к антибиотикам у возбудителей нозокомиальных инфекций семейства Enterobacterobacteriaceae, выделенных в 2005-2007 гг. //Материалы международной научной конференции «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18-20 мая 2010 г.

20. Фурсова Н.К., Прямчук С.Д., Кужельная Е.Н., Абаев И.В., Светоч Э.А. Интегроны 1 и 2 классов в геномах грамотрицательных возбудителей нозокомиальных и пищевых инфекций //Материалы Первой международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17-19 ноября 2010 г..

21. Асташкин Е.И., Прямчук С.Д., Светоч Э.А., Фурсова Н.К. Характеристика нозокомиальных штаммов Salmonella enterica. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Тезисы XII Международног

 


Похожие работы:

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«ЛАТКИНА ЕЛЕНА ИВАНОВНА РАСПРОСТРАНЕНИЕ ОТОДЕКТОЗА СОБАК И КОШЕК В СУРГУТСКОМ РАЙОНЕ ХАНТЫ-МАНСИЙСКОГО АВТОНОМНОГО ОКРУГА И ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ПРИ ЭТОЙ ИНВАЗИИ 03.00.19 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии и в условиях клиники Сургутской...»

«ПЕСТОВ АРТУР ЮРЬЕВИЧ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БИОЦЕНОЗА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ КАРИЕСЕ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный...»

«МАРКОВА Юлия Александровна ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ 03.02.03-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в ФГБУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования Министерства...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«Шрамко Павел Александрович РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ОБОЛЕНСК-2012 Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки Государственный...»

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«Павлов Виталий Михайлович Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis 03.02.03– микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. НАУЧНЫЙ...»

«Жадченко Юлия Викторовна Распространенность стафилококков в популяции лиц, живущих в крупном промышленном городе 03.02.03 – Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«ШАРПАН Мария Владимировна МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРЯ 03.00.16 – Экология (физико-математические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук К раснодар 200 8 Работа выполнена на кафедре прикладной математики ГОУ ВПО К убанский государственный...»

«МИНВАЛЕЕВ Ринад Султанович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ВНУТРИОРГАННОГО КРОВОТОКА ПРИ ИЗБРАННЫХ ПОЗАХ ЧЕЛОВЕКА (ПО ДАННЫМ ДОППЛЕРЭХОГРАФИИ) 03.00.13 - физиология человека и животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 1999...»

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭПИЗООТОЛОГИЯ ТРЕМАТОДОЗОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРОТИВОТРЕМАТОДОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РЕСПУБЛИКЕ АЛТАЙ Специальность 03.02.11 - Паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2010 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук Научный...»

«Шамова Ольга Валерьевна Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения...»

«Золотарева Наталья Владимировна Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2011 Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

«Артамонов Александр Юрьевич ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУН ГНЦ ПМБ ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный...»

«Неверов Алексей Дмитриевич КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ СПЛАЙСИНГА 03.00.03 - Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук - Москва 2007 – Работа выполнена в лаборатории биоинформатики Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ФГУП “ГосНИИ генетика”. Научный руководитель : доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук Миронов Андрей Александрович...»

«ЕЛИСТРАТОВА Людмила Леонтьевна КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АКНЕПОДОБНЫХ ДЕРМАТОЗОВ, ОСЛОЖНЕННЫХ ДЕМОДЕКОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Министерства здравоохранения...»






 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.