WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации reca и recd

На правах рукописи


Лапин

Александр Александрович

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ВАРИАНТОВ ВАКЦИННОГО ШТАММА FRANCISELLA TULARENSIS

С ДЕЛЕТИРОВАННЫМИ ГЕНАМИ СИСТЕМЫ

РЕКОМБИНАЦИИ RECA И RECD


03.02.03 – микробиология

03.01.03 – молекулярная биология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук




Оболенск – 2011

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат физико-математических наук Павлов Виталий Михайлович

Кандидат медицинских наук Мокриевич Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Гремякова Татьяна Андреевна

Кандидат биологических наук Воложанцев Николай Валентинович

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора

Защита состоится «____»___________ 2011 г. на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «____»___________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туляремия – зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. На территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (по данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, в 2010 г. зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 г. – 57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.

Возбудителем туляремии является микроорганизм Francisella tularensis. В современной классификации выделяют четыре подвида F. tularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica, subsp. mediaasiatica и subsp. novicida. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает F. tularensis subsp. tularensis, циркулирующий на территории Северной Америки (Ellis et al., 2002).

Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, которая формирует длительный напряженный иммунитет. Основным недостатком данной вакцины является ее некоторая реактогенность и нестабильность (Олсуфьев с соавт., 1960). Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из способов стабилизации генома вакцинного туляремийного штамма представляется инактивирование элементов системы гомологичной рекомбинации.

Известно, что инактивирование гена recA у вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG приводило к стабилизации генома данного микроорганизма и не влияло на его протективные свойства (Keller et al., 2008). Инактивация генов recA и recBC в клетках Salmonella приводила к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае recA мутантов) (Buchmeier et al., 1993). Наличие дефекта в гене recD у Salmonella, продуктом которого является белок RecD, обладающий АТФ-азной (Chen et al., 1997) и хеликазной (Taylor et al., 2003) активностями, также приводило к аттенуации бактерий Salmonella для мышей и снижению их пролиферации в макрофагах (Cano et al., 2002).

Ранее было показано наличие функционально-активного recA-подобного гена в геноме вакцинного штамма F. tularensis (Павлов с соавт., 1991) и в геноме F. tularensis subsp. novicida (Berg et al., 1992). При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности геномов видов Francisella были обнаружены также recD-подобные гены (Larsson et al., 2005).

Учитывая вышеизложенные факты, изучение влияния recA- и recD-подобных генов F. tularensis на генетические и биологические свойства вакцинного штамма туляремийного микроба является на настоящий момент актуальной задачей, решение которой необходимо для создания нового поколения вакцинного штамма, а также для изучения эволюции туляремийного микроба.

Цель исследования: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма F. tularensis.





задачи исследования

  1. Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD у F. tularensis.
  2. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recA.
  3. Получение продуцента E. coli Bl21(DE3), экспрессирующего рекомбинантный белок RecA F. tularensis, выделение и очистка белка RecA.
  4. Получение антител к рекомбинантному белку RecA F. tularensis и анализ экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба.
  5. Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recD.
  6. Изучение влияния генов recA и recD на свойства вакцинного штамма F. tularensis 15/10.
  7. Выбор последовательностей нуклеотидов в гене recD для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов F. tularensis; конструирование праймера, содержащего Chi-сайт E. coli, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.

Научная новизна

Впервые получены варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с инактивированными генами системы гомологичной рекомбинации recA и recD. Показано, что при инактивации гена recA в геноме штамма F. tularensis 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к аттенуированию штамма, при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.

Практическая ценность работы

Созданы плазмиды pPVrecA, pPVrecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации recA и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (ГКПМКК-Оболенск) депонированы авторские штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15/10recA (рег. номер 6622.) с делецией гена recA, и F. tularensis subsp. holarctica 15/10 recD (рег. номер В-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» № 2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).

положения, выносимые на защиту

1. Делеция гена recA в геноме вакцинного штамма F. tularensis 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена recA сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм F. tularensis 15/10recA сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лиофильно высушенной культуры F. tularensis 15/10recA не меняется в процессе ее хранения.

2. Антитела к рекомбинантному белку RecA распознают нативный белок RecA штамма F. tularensis 15/10. Количество белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.

3. Делеция гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к подавлению гомологичной рекомбинации. Штамм F. tularensis 15/10recD не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными ростовыми свойствами и замедленной способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.

4. У штамма F. tularensis 15/10 с инактивированным геном recA на порядок снижена вирулентность для мышей, при сохранении его протективных свойств. Делеция гена recD у вакцинного туляремийного штамма приводит к его аттенуированию и сохранению протективных свойств.

5. Созданная система праймеров и зондов на основе вариабельной последовательности гена recD позволяет проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий Chi-последовательность E.coli, позволяет различать подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии (ЛМТ) ФБУН ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 11.06.2009 г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 гг.)».



Апробация работы

Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.

Публикации

Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях журнала из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в двух принятых к рассмотрению заявках на патент Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 20 работ отечественных и 151 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Обзор литературы

В первых главах приведены данные о возбудителе туляремии и лабораторной диагностики данной инфекции. Изложена история получения и использования туляремийного вакцинного штамма. Проанализированы литературные данные, касающиеся функционирования системы гомологичной рекомбинации у микроорганизмов. Приведена история исследования модели гомологичной рекомбинации. Основная часть обзора посвящена работам по исследованию функционирования основных ферментов системы гомологичной рекомбинации - белкам RecA и RecBCD. Приведены данные об организации генома F. tularensis. Рассмотрены подходы генетического изучения туляремийного микроба. Заключительная часть литературного обзора посвящена вопросу применения генетической модификации системы рекомбинации у вакцинных штаммов в том числе и F. tularensis, для стабилизации и аттенуации вакцинных штаммов.

Глава 2. Материалы и методы исследования

В работе использовали полученные из коллекции ГКПМКК-Оболенск бактериальные штаммы: - F. tularensis subsp. tularensis - 3 штамма, F. tularensis subsp. mediasiatica - 2 штамма, F. tularensis subsp. Novicida - 1 штамм, F. tularensis subsp. holarctica - 6 штаммов, из которых F. tularensis subsp. holarctica biovar japonica - 3 штамма и вакцинный штамм F. tularensis, subsp. holarctica 15/10, а также гетерологичные штаммы Y. pestis EV76, Y. pseudotuberculosis 1779, B. anthracis СТИ-1 и E. coli JM 83, E. coli DH5, E. coli S17-1 и E. coli Bl21(DE3).





Мышиные макрофагоподобные клетки линии J744.A1 были получены из Российской Коллекции клеточных культур, г. Санкт-Петербург, Россия.

В работе были использованы мыши линии BALBc (возраст 6-8 нед.) и беспородные белые мыши массой 18-20 г, полученные из вивария ФБУН ГНЦ ПМБ, соответствующие требованиям к качеству лабораторных грызунов (Лившиц, 1978).

Культивирование штаммов E. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Лурия-Бертани (LB) при температуре 37 °С (Miller, 1972) с добавлением при необходимости антибиотиков: хлорамфеникола (Cm) 10 мг/л, ампициллина (Ap) 100 мг/л, канамицина (Km) 40 мг/л и 5% сахарозы (Suc). Культивирование штаммов F. tularensis проводили при температуре 37 С на среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ) и жидкой питательной среде (Лапин с соавт., 2009), при необходимости в питательные среды добавляли антибиотики: полимиксин (Pm) 100 мг/л, Km 10 мг/л, Cm 3 мг/л, стрептомицин (Str) 100 мг/л и 5% Suc.

Лиофильное высушивание подготовленных суспензий объемом 2 мл проводили с использованием сушилки Bench Top SLC "Virtis" 4 k (США) при автоматическом режиме подвода тепла (2030 0С) в течение 24 ч (глубина вакуума - 200 мТорр).

Молекулярно-биологические работы выполняли в соответствии с руководством Маниатиса с соавт. (1984). Перенос рекомбинантных плазмид в клетки штаммов E. coli осуществляли “кальциевым” методом трансформации, а в клетки F. tularensis15/10 - методом конъюгации (Golovliov et al., 2003).

Олигонуклеотиды синтезировали в компании ЗАО «Синтол» (Москва, Россия).

ПЦР проводили с использованием термоциклера Gene Amp PCR System 2700 (Applied Biosystems,США).

ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Inc, США) c оптическим ПЦР-модулем.

Секвенирование нуклеотидных последовательностей ДНК проводили с использованием метода Сэнгера на секвенаторе ALF express II (Amersham Pharmacia Biotech, США) в компании «Синтол» (Москва, Россия).

Конструирование штаммов с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD на основе штамма F. tularensis subsp. holarctica 15/10 проводили с помощью аллельного обмена по методике Golovliov et al (2003). Для синтеза модифицированных фрагментов генов recA и recD использовали ампликоны, полученные с помощью праймеров FSA, RBA, FBA, RSA и FSD, RBD, FBD, RSD, соответственно. Дефектные аллели генов recA и recD встраивали в SalI сайт суицидного вектора pPV. Для комплементации мутаций в генах recA и recD, фрагменты хромосомной ДНК F. tularensis 15/10 с функционально активным геном recA встраивали в SalI сайт вектора pHV33mob, а фрагмент ДНК с геном recD - в SalI сайт векторов pHV33-mob и pUC19/pK194. Для получения плазмиды pET23(b+)/RecA-(His)6, экспрессирующей белок RecA F. tularensis в клетках E. coli, ген recA F. tularensis 15/10 встраивали между сайтами NdeI и XhoI в векторе pET23(b+).

Очистку рекомбинантного белка RecA из цитоплазматической фракции штамма-продуцента E. coli Bl21 (pET23(b)+/RecA-(His)6) проводили металл-хелатирующей хроматографией в неденатурирующих условиях на носителе Ni2+NTAHisBind® Superflow™(Pharmacia Biotech, Швеция).

Концентрацию белка определяли по методу Lowry et al. (1951), электрофорез белков проводили по методу Лэмли (Laemly, 1970).

Иммуноблоттинг проводили по методу Товбина (Towbin et al., 1979). Иммуноферментный анализ (ИФА) проводили согласно руководству (Ngo 1988).

Индукцию белка RecA F. tularensis 15/10 проводили с использованием налидиксовой кислоты при концентрации 40 мг/л (Weinstock et al., 1979) и с помощью УФ-облучения при длине волны 245 нм.

Чувствительность бактерий к перекиси водорода (H2О2) определяли диско-диффузионным методом с помощью дисков диаметром 5 мм.

Определение чувствительности клеток туляремийного микроба к УФ-облучению проводили с помощью UV-облучателя при длине волны 245 нм (Cole Parmer, США).

Устойчивость микробов к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки (НКС) оценивали по выживаемости бактерий в суспензии плотностью 1106 КОЕ/мл после инкубирования с сывороткой при температуре 37 °С в течение 24 ч.

Эффективность размножения клеток туляремийного микроба в макрофагах оценивали по разнице между десятичными логарифмами КОЕ, полученными при высевах лизатов макрофагов через 3 ч и 48 ч после инфицирования клетками штаммов F. tularensis.

Определение LD50 проводили согласно методу Кербера в модификации (Ашмарин, 1962).

Для оценки протективности модифицированных туляремийных штаммов вакцинированных мышей заражали подкожно культурой F. tularensis 503 в дозе 1102 КОЕ/мышь (DCL штамма F. tularensis 503 для мышей линии BALB/c составляет 1 КОЕ/мышь) через 28 суток после вакцинации. Достоверность отличий количественных значений экспериментов определяли по t-критерию Стьюдента (P<0,05) с помощью статиcтических программ, встроенных в программу Windows Excel.

Глава 3.Результаты исследований

Получение штаммов F. tularensis, дефектных по генам системы

рекомбинации recA и recD

У бактерий F. tularensis, как у большинства микроорганизмов, ключевыми белками системы рекомбинации являются белок RecA и RecBCD-мультиферментный комплекс экзонуклеазы V.

Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей гена recA у разных вижов и подвидов франциселл показал, что сходство генов на уровне подвидов F. tularensis составляет 99 %, а на уровне видов F. tularensis и F. phylomiraghia – 81 %. Сравнение нуклеотидных последовательностей гена recD показало 90 %-ное сходство на уровне подвидов F. tularensis и 85 %-ное сходство - на уровне видов F. tularensis F. phylomiraghia.

Проведенное множественное выравнивание представленных в базе данных NCBI аминокислотных последовательностей белка RecA показало на уровне подвидов F. tularensis различие только по одной аминокислоте, а на видовом уровне различия между F. tularensis и F. phylomiraghia - в виде единичных аминокислотных замен и делеций. Белок RecD обладал вариабельностью в аминокислотной последовательности как на уровне видов, так и на уровне подвидов, которая проявлялась в виде многочисленных аминокислотных замен и протяженных областей делеций.

При помощи плазмиды pPVrecA нами был получен штамм F. tularensis 15/10 с делецией гена recA. Наличие делеции в области данного гена было подтверждено в ПЦР и иммуноблоттингом (рис 1, 2).

Рисунок 1 - ПЦР-анализ клонов штамма F. tularensis 15/10recA: M – маркер Hind (23130, 9416, 6557, 4316, 2322, 2027, 564, 125 т.п.о.); 1- исходный вариант F. tularensis 15/10 с нативной копией гена recA (4009 п.о); 2,3, 4 – F. tularensis 15/10recA с делетированным вариантом гена recA (2949 п.о)

Анализ экспрессии гена recA и синтеза белка RecA F. tularensis 15/10

Показано, что полученный нами штамм E. coli BL21(pET23(b)+/RecA-(His)6) экспрессировал рекомбинантный белок RecA-(His)6 с молекулярной массой около 42 кДа, который при выделении из клеток E. coli находился в цитоплазматической фракции в растворимой форме. Очищенный препарат рекомбинантного белка агрегировал при комнатной температуре, а при снижении температуры снова переходил в растворимую форму. Иммунизация мышей рекомбинантным белком RecA-(His)6 позволила получить специфическую сыворотку к белку RecA-(His)6 с титром антител, равным 1:3016. Полученная антисыворотка выявляла одну полосу с молекулярной массой 43 кДа в лизате клеток штамма F. tularensis 15/10 (рис. 2). Сыворотка к рекомбинантному белку RecA выявляла также единичные белковые полосы в лизатах клеток E. coli и Y. pestis с молекулярной массой 38 кДа, что соответствует теоретическому значению молекулярных масс белка RecA у этих микроорганизмов. Общность иммунологических эпитопов белка RecA у различных микроорганизмов согласуется с данными анализа аминокислотных последовательностей и свидетельствует о высокой степени его консервативности. Следует отметить, что молекулярная масса нативного белка RecA F. tularensis 15/10 (43 кДа) отличалась от теоретической (39 кДа), что может быть обусловлено посттрансляционной модификацией белка RecA (Fischer et al., 2004).

1 2 3 4 5 6
Рисунок 2 - Оценка специфичности антисыворотки к рекомбинантному белку RecA-(His)6 (12,5% ДСН-ПААГ): 1 –Y. pestis EVлинии НИИЭГ; 2 – F. tularensis 15/10; 3– F. tularensis 15/10recA; 4 – E. coli BL21; 5 – рекомбинантный белок RecA-(His)6; 6 – окрашенные маркеры «Fermentas» (Литва)


Оценка индукции нативного белка RecA F. tularensis 15/10

С помощью метода иммуноблоттинга было показано, что после воздействия УФ-облучения на клетки штамма F. tularensis 15/10 уровень экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба не менялся (рис. 3). Аналогичные данные были получены после индукции налидиксовой кислотой. Таким образом, показано, что регуляция синтеза белка RecA у F. tularensis 15/10 отличается от регуляции синтеза белка RecA у других микроорганизмов (рис.  4).

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
А Б
Рисунок 3 - Индукция белка RecA под действием УФ-облучения (12,5% ДСН -ПААГ); А-облучение в течение 10 с: линия 1 – 0 с, 2 – 30 мин, 3 – 1 ч, 4 – 2 ч, 5 – 4 ч культивирования, 6 – белок RecA-(His)6 ; Б-облучение в течение 80 с: линия 1 – 0 с, 2 – 30 мин, 3 – 1 ч, 4 – 2 ч, 5 – 4 ч культивирования, 6 – белок RecA-(His)6







1 2 3
Рисунок 4 - Индукция белка RecA после воздействия налидиксовой кислотой (12,5% ДСН-ПААГ); 1 и 2 – клетки F. tularensis 15/10 до и после воздействия налидиксовой кислоты, 3 – белок RecA-(His)6

Последующую оценку уровня транскрипционной активности гена recA F. tularensis 15/10 проводили полуколичественным анализом при помощи обратно-транскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени. Проведенный анализ выявил одинаковое количество иРНК на разных фазах роста F. tularensis 15/10 в течение 0-6ч культивирования в жидкой питательной среде, что косвенно свидетельствовало о конститутивном синтезе белка RecA F. tularensis(рис. 5).

Рисунок 5 - Анализ транскрипционной активности гена recA F. tularensis 15/10 при культивировании в течение 0-6 ч. Зеленым цветом обозначены кривые амплификации региона гена recA, коричневым цветом выделены кривые амплификации региона гена dnaA

С использованием плазмиды pPVrecD нами был получен штамм F. tularensis 15/10 с делецией гена recD. Наличие делеции гена recD было подтверждено в ПЦР (рис 6).

М 1 2 3 4
Рисунок 6. ПЦР-анализ полученных клонов штамма F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD; M – маркер Hind (23130, 9416, 6557, 4316, 2322, 2027, 564, 125 т.п.о.); 1- исходный вариант F. tularensis 15/10 с нативной копией гена recD (3498 п.о); 2,3, 4 –F. tularensis 15/10recD c делетированный вариантом гена recD (2895 п.о)

Для комплементации модифицированных генов recA и recD у штаммов F. tularensis15/10recA, F. tularensis 15/10recA были сконструированы плазмиды pHV33-mob/recA, pHV33-mob/recD и pUC19/pK194/recD, реплицирующиеся в клетках F. tularensis 15/10 и содержащие функционально активные гены recA и recD. Полученные плазмиды переносили в штаммы F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD, соответственно.

Изучение биологических и иммунологических свойств мутантных штаммов


Оценка способности к гомологичной рекомбинации штаммов Ftularensis с делециями генов recA и recD. Для подтверждения роли генов recA и recD в гомологичной рекомбинации в полученные штаммы переносили суицидную плазмиду с фрагментом хромосомной ДНК F. tularensis 15/10. Частота интеграции суицидной плазмиды в хромосомную ДНК штамма F. tularensis 15/10 составляла 10-7, а для F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD - менее 10-9. Таким образом, делеция генов recA и recD приводила к снижению частоты рекомбинации более чем в 100 раз. Введение плазмиды pUC19/pK194/recD с функционально активным геном recD в клетки F. tularensis с инактивированным геном recD восстанавливало способность штамма к интеграции суицидной плазмиды в хромосомную ДНК до исходного уровня 10-7.


Оценка динамики роста штаммов Ftularensis с делециями генов recA и recD in vitro

Показано, что в жидкой питательной среде штамм F. tularensis15/10recA по ростовым свойствам сопоставим с исходным штаммом F. tularensis 15/10 (рис. 7).

Рисунок 7. Динамика роста вакцинных штаммов F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10recA

В отличие от него, штамм F. tularensis 15/10 с делецией гена recD растет значительнее медленнее родительского штамма (рис. 8). На плотной питательной среде штамм F. tularensis 15/10recD формировал колонии меньшего размера, по сравнению со штаммами F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10recA.

Рисунок 8. Динамика роста вакцинных штаммов F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10recD(pHV33-mob), F. tularensis 15/10recD(pHV33-mob/recD), F. tularensis 15/10recD

Для подтверждения влияния гена recD на рост культуры F. tularensis 15/10recD в мутантный штамм была введена плазмида pHV33-mob/recD с функционально активным геном recD. Восстановление синтеза белка RecD в клетках штамма F. tularensis 15/10recD pHV33-mob/recD приводило к реверсии его ростовых свойств до уровня родительского штамма как на жидкой (рис. 8), так и на плотной питательной среде.


Оценка выживаемости штаммов Ftularensis с делециями генов recA и recD после лиофильного высушивания

Сравнение жизнеспособности полученных вариантов вакцинного штамма F. tularensis после лиофильного высушивания и хранения в течение месяца показало, что жизнеспособность лиофильно высушенных клеток штамма F. tularensis 15/10recA не отличалась от исходного, а жизнеспособность клеток штамма F. tularensis 15/10recD снизилась (табл. 1).

Таблица 1 - Выживаемость лиофильно высушенных клеток штаммов F. tularensis 15/10, F. tularensis 15/10recD и F. tularensis 15/10recA при хранении

Название штамма Выживаемость, %
Исходная После лиофилизации Хранение в течение месяца при температуре
+40С +250С
F. tularensis 15/10 100 93 88 80
F. tularensis 15/10recD 100 69 66 64
F. tularensis 15/10recA 100 87 86 82


Оценка частоты возникновения стрептомицин-резистентных мутантов штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD

Частота появления стрептомицин-резистентных мутантов для штаммов F. tularensis 15/10recA, F. tularensis 15/10recD и F. tularensis 15/10 равна 10-9, что подтверждает отсутствие влияния генов системы рекомбинации recA и recD на спонтанный мутагенез.


Оценка устойчивости к ультрафиолетовому облучению штамма F. tularensis 15/10 с делецией гена recA

Показано, что клетки штамма F. tularensis 15/10recA обладали повышенной чувствительностью к УФ-облучению, по сравнению с исходным штаммом F. tularensis 15/10. Введение плазмиды pHV33-mob/recA с геном recA в клетки F. tularensis 15/10recA полностью восстанавливало устойчивость бактерий к УФ-облучению (табл. 2).

Таблица 2 - Воздействие УФ облучения на штаммы F. tularensis 15/10 и F. tularensis 15/10recA

Время экспозиции, сек F. tularensis 15/10 F. tularensis 15/10recA F. tularensis 15/10recA: pHV33-mob/recA F. tularensis 15/10recA: pHV33-mob
Концентрация живых клеток после УФ – облучения (Lg KOE/мл)
0 9,14 9,3 8,91 9,2
10 9,04 7 8,81 7,01
20 9,01 6,6 8,47 6,02
40 8,7 6,25 8,37 5,36
80 8,0 5 8,16 4,47
160 6,9 - 7,51 -

Оценка воздействия перекиси водорода на клетки штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD

Чувствительность клеток штаммов F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD к бактерицидному действию перекиси водорода (H2О2) была сравнима с таковой для клеток F .tularensis 15/10. При концентрации H2O2 1 % зона подавления роста дефектных штаммов не отличалась от исходного штамма и составляла 0,9 см, что говорит о сохранении устойчивости к воздействию перекиси водорода.

Размножение клеток штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD в макрофагах

Сравнительный анализ роста клеток штаммов F. tularensis в макрофагоподобных клетках J774.1A. показал, что делеция гена recA практически не влияет на размножение бактерий в макрофагах, а делеция гена recD приводит к замедлению их размножения в макрофагоподобных клетках.


Определение устойчивости клеток штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD к нормальной кроличьей сыворотке

Бактерицидная активность НКС против клеток штаммов F. tularensis 15/10recA, F. tularensis 15/10recD и F. tularensis 15/10 была одинакова, и выживаемость бактериальных клеток всех исследуемых штаммов F. tularensis составляла 10-30 %.


Определение остаточной вирулентности штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD

Показано, что LD50 штамма F. tularensis 15/10recA для мышей по сравнению с исходным штаммом F. tularensis 15/10 снизилась на порядок, а вирулентность штамма F. tularensis 15/10recD снизилась на шесть порядков.


Оценка протективности штаммов F. tularensis 15/10 с делециями генов recA и recD на мышиной модели

Проверка иммуногенности дефектных штаммов F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD показала сохранение у них протективных свойств, характерных для исходного штамма (табл. 3.).


Таблица 3 - Протективность штаммов F. tularensis 15/10, F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD для мышей линии BALB/c

Доза иммунизации, КОЕ/мышь Доза заражения F. tularensis 503 КОЕ/мышь Выживших животных, %
Иммунизация F. tularensis 15/10 Иммунизация F. tularensis 15/10 reca Иммунизация F. tularensis 15/10 recd
1102 1102 100 100 100
1103 100 100 100
1104 100 100 100
1105 НД НД 100
Контроль 0



Создание системы из одного праймера для дифференциации подвидов туляремийного микроба на основе специфических регионов хромосомы F. tularensis,

фланкированных Сhi- последовательностями подобными E. coli

Использование праймера Chi 1f 5`CTAGG-GCTGGTGG-G3`, содержащего Chi-сайт E. coli, позволило дифференцировать подвиды F. tularensis методом ПЦР (рис. 9.). Данный праймер можно использовать не только для межвидовой и видовой, но и родовой дифференциации (рис. 10.).

Рисунок. 9. Электрофореграмма ампликонов, полученных в ПЦР с праймером Chi 1f и ДНК F. tularensis: 1–11 – GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder; 2 – subsp. holarctica 15; 3 – subsp. holarctica 503; 4 – subsp. holarctica bv. japonica Miura; 5 – subsp. holarctica bv. japonica Jasoe; 6 – subsp. tularensis 8859; 7 – subsp. tularensis Schu; 8 – subsp. mediasiatica 120; 9 – subsp. mediasiatica 117; 10 – subsp. novicida Utah 112 Рисунок. 10. Электрофореграмма ампликонов, полученных в ПЦР с праймером Chi 1f и ДНК различных видов микроорганизмов: 1–8 – GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder; 2 – F. tularensis subsp. holarctica 503; 3 – F. tularensis subsp. tularensis Schu; 4 – F. tularensis subsp. mediasiatica 120; 5 – S. enteritidis; 6 – Y. pestis EV76; 7 – E. coli JM83

Создание системы праймеров и зондов для ПЦР в реальном времени для индикации и идентификации подвидов F. tularensis на основе

последовательности гена recD

Использование праймеров recD845A/B F, recD845A/B R, recD886Non-pat F, recD886Non-patR и зондов recD845A/B, recD845A/B, recD886 Non-pat, созданных на основе анализа последовательностей гена recD в штаммах F. tularensis, позволяет дифференцировать подвиды туляремийного микроба в ПЦР-РВ (табл. 4). Чувствительность системы праймеров и зондов составляет - 1104 КОЕ/мл.


Таблица 4 - Результаты испытания мультиплексных тест-систем для выявления ДНК штаммов F. tularensis и гетерологичных микроорганизмов

Микроорганизмы, штаммы Наличие сигнала или детектируемого гена по каналу
recD 845 A recD 845 B
FAM HEX (R-6-G)
1 F. tularensis subsp. tularensis Schu + -
2 F. tularensis subsp. tularensis B399 A-Cole + -
3 F. tularensis subsp. tularensis 8859 + -
4 F. tularensis subsp. holarctica 9 - +
5 F. tularensis subsp. holarctica 21/400 - +
6 F. tularensis subsp. holarctica 15/10 - +
7 F. tularensis subsp. holarctica 503 - +
8 F. tularensis subsp. holarctica japonica Miura + -
9 F. tularensis subsp. holarctica japonica Jasoe + -
10 F. tularensis subsp. mediasiatica 117 + -
11 F. tularensis subsp. mediasiatica 120 + -
12 F. tularensis subsp. novicida 112 Nov - -
13 Y. pestis ssp. pestis EV76 - -
14 Y. pseudotuberculosis - -
15 B.anthracis СТИ-1 - -
16 E.coli JM 83 - -


ВЫВОДЫ

1. Показано, что гомология нуклеотидных последовательностей гена recA подвидов F. tularensis составляет 99 %, а на уровне видов у F. tularensis и F. phylomiraghia снижается до 81 %. Гомология последовательностей гена recD для разных подвидов F. tularensis составляет около 90 %, а для видов F. tularensis и F. phylomiraghia -85 %. Белки RecA видов F. tularensis и F. phylomiraghia отличаются единичными аминокислотными заменами и делециями; в аминокислотных последовательностях белка RecD у разных видов и подвидов туляремийного микроба присутствуют протяженные области делеций и многочисленные аминокислотные замены.

2. Создан продуцент E. coli, синтезирующий рекомбинантный белок RecA F. tularensis 15/10, состоящий из 359 а.о. продукта гена recA и 6 остатков гистидина. Мышиная сыворотка к рекомбинатному белку RecA F. tularensis 15/10 выявляет белковую полосу с молекулярной массой 43 кДа в лизате клеток F. tularensis 15/10, а также белковые полосы с молекулярной массой 38 кДа в лизатах клеток E. coli и Y. pestis.

3. Количество белка RecA в клетках F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется; транскрипционная активность гена recA в течение логарифмической фазы роста клеток F. tularensis 15/10 в жидкой питательной среде, определенная методом ПЦР-РВ, не меняется, что косвенно указывает на конститутивный синтез данного белка в клетках туляремийного микроба.

4. Получен штамм F. tularensis 15/10reca, культурально-морфологические свойства которого при выращивании на плотных и жидких питательных средах, способность выживать в нормальной кроличьей сыворотке и размножаться в макрофагоподобных клетках J774.A1, чувствительность к пероксиду водорода и частота возникновения стрептомицин-резистентных мутантов существенно не отличаются от таковых исходного вакцинного штамма. Однако, у штамма F. tularensis 15/10recA, по сравнению с исходным, подавлена способность к гомологичной рекомбинации и повышена чувствительность к УФ-облучению.

5. Получен штамм F. tularensis 15/10 recD, обладающий сниженной способностью к размножению в макрофагоподобных клетках J774.A1, подавленным ростом на плотных и жидких питательных средах, сниженной способностью к гомологичной рекомбинации, по сравнению с исходным вакцинным штаммом. При этом чувствительность данного штамма к пероксиду водорода и частота возникновения стрептомицин-резистентных мутантов не изменились.

6. Показано, что протективные свойства штаммов F. tularensis 15/10recA и F. tularensis 15/10recD не изменились по сравнению с исходным вакцинным штаммом. Однако, остаточная вирулентность штамма F. tularensis 15/10recA ниже на порядок, а штамма F. tularensis 15/10recD - на шесть порядков, по сравнению с таковой штамма F. tularensis 15/10.

7. Система праймеров и зондов, созданная для детекции гена recD методом ПЦР в реальном времени, обладает специфичностью, позволяющей дифференцировать подвиды туляремийного микроба.

8. Разработана ПЦР-система дифференциации подвидов F. tularensis с помощью праймера Chi 1f.

Список работ, опубликованных по теме диссертации


а) в журналах, рекомендованных ВАК

1. Лапин А.А., Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Домотенко Л.В., Храмов М.В. Простая жидкая питательная среда для молекулярно-генетических исследований Francisella tularensis.// Проблемы особо опасных инфекций. - 2009. - №102. - С. 66-67.

2. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И. В., Дятлов И.А., Павлов В.М. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма Francisella tularensis 15/10 с делетированным геном recA. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. (Принята в печать).

3. Лапин А.А., Кравченко Т. Б. , Мокриевич А. Н. , Вахрамеева Г. М. , Комбарова Т. И. , Дятлов И. А. , Павлов В. М.  Влияние УФ-облучения и налидиксовой кислоты на индукцию RecA белка Francisella tularensis 15/10. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. (Принята в печать).

4. Г.М.Вахрамеева, А.А.Лапин, В.М.Павлов, А.Н.Мокриевич, Р.И.Миронова, И.А.Дятлов. ПЦР дифференциация подвидов Francisella tularensis с помощью одного праймера. // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011. - №107. - С. 46-46.

б) заявки на патенты

7. Павлов В.М., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р. И., Комбарова Т.И., Лапин А.А. Заявка на получение патента на изобретение «Способ стабилизации туляремийного вакцинного штамма» под № 2010141704 от 11.10.2010.

8. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Миронова Р. И., Комбарова Т.И., Игнашина Е.Н., Павлов В.М. Заявка на получение патента на изобретение «Способ аттенуации туляремийного вакцинного штамма» под №2011131560 от 28.07.2011.

в) тезисы конференций

5. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Комбарова Т.И., Бахтеева И.В., Павлов В.М. Получение дефектного по recD гену вакцинного варианта Francisella tularensis 15/10 и изучение его свойств // Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.) Оболенск, 2010, С. 282-284.

6. Лапин А.А., Мокриевич А.Н., Вахрамеева Г.М., Павлов В.М. Получение штамма Francisella tularensis 15/10 с делетированным геном recA и изучение его биологических свойств // Материалы III научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая -2 июня 2011 г.) Оболенск, 2011, С. 322-324.

9. Лапин А.А., Вахрамеева Г.М., Павлов В.М., Мокриевич А. Н. , Миронова Р. И., Дятлов И.А. Универсальный праймер для ПЦР дифференциации подвидов возбудителя туляремии// Третий съезд военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации» (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) Санкт-Петербург, 2010, С. 290-291.



 


Похожие работы:

«Шамова Ольга Валерьевна Молекулярно - клеточные основы реализации биологической активности антимикробных пептидов лейкоцитов 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения...»

«Артамонов Александр Юрьевич ЭФФЕКТЫ ДЕЙСТВИЯ ПРИРОДНЫХ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИХ АНАЛОГОВ С РАЗЛИЧНЫМИ ИЗМЕНЕНИЯМИ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛЫ 14.03.03 – патологическая физиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Отделе общей патологии и патофизиологии Федерального государственного бюджетного учреждения Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины...»

«ПЕСТОВ АРТУР ЮРЬЕВИЧ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ БИОЦЕНОЗА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ КАРИЕСЕ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Волгоград 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Волгоградский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный...»

«Блохина Светлана Викторовна ЭПИЗО ОТО ЛОГИЯ ЦИСТНО ГО ЭХИНОКОККОЗ А В ОМСКОЙ О Б ЛАСТИ 03.00.19 - паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень - 2009 Работа выполнялась в ФГУ ВПО Омский государственный аграрный университет и в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«Неверов Алексей Дмитриевич КОМПЬЮТЕРНЫЙ АНАЛИЗ СПЛАЙСИНГА 03.00.03 - Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук - Москва 2007 – Работа выполнена в лаборатории биоинформатики Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов ФГУП “ГосНИИ генетика”. Научный руководитель : доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук Миронов Андрей Александрович...»

«Сабарайкина Светлана Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КРАСНЫХ СМОРОДИН ПОДРОДА RIBESIA L. В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2009 Работа выполнена в филиале Ботанический сад Института биологических проблем криолитозоны СО РАН. Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич кандидат...»

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«Павлов Виталий Михайлович Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis 03.02.03– микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. НАУЧНЫЙ...»

«Потапов Василий Дмитриевич РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Оболенск – 2013 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«Золотарева Наталья Владимировна Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2011 Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ МАРТ авторефераты 1. Александрова, Наталья Владимировна. Состояние системы мать-плацента-плод, течение и исходы беременности, наступившей с использованием вспомогательных репродуктивных технологий : автореферат диссертации. доктора медицинских наук : 14.01.01 / Н. В. Александрова ; конс.: О. Р. Баев, Г. Т. Сухих ; Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова (М.). - М. : б. и., 2013. - 46 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1).

«Шверина Ольга Викторовна Возрастная характеристика функционального состояния организма с учетом его субъективной оценки (на примере преподавателей вуза) 03.00.13-физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2007 Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Анатолий Яковлевич Рыжов Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУН ГНЦ ПМБ ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный...»

«киршева надежда алексеевна СТРУКТУРА ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ И ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ВИРУЛЕНТНОСТЬ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФОТОРАБДОЗА 03.02.03 – микробиология 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2013 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки...»

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:




 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.