WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза

На правах рукописи

Низова Анастасия Валерьевна

Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй

линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных

с хроническим течением туберкулеза

03.00.07 – Микробиология

03.00.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

кандидат биологических наук Степаншина Валентина Николаевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимирский Михаил Александрович

доктор медицинских наук, Денисов Александр Александрович

Ведущая организация – Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера

Защита состоится «18» декабря 2009 г. в 12 00 часов на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (ФГУН ГНЦ ПМБ) Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии.

Автореферат разослан «12» ноября 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Туберкулез остается серьезной проблемой здравоохранения во всем мире. Возбудителем туберкулеза инфицировано около трети населения планеты [Bloom B.R., 2002, Никитин А.В., 2006]. Ежегодно от туберкулеза умирает 3 млн. человек. В Российской Федерации показатель заболеваемости населения туберкулезом составляет около 86 случаев на 100 000 населения [Вартанян Ф.Е. и др., 2007; Цыбикова Э.Б. и др., 2007]. Примерно третья часть от общего числа больных являются бактериовыделителями, т.е. существует огромный резервуар распространителей инфекции [Дмитриев В.А., 2008].

Одной из причин сохранения сложной эпидемической ситуации по туберкулезу является увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к специфическим химиопрепаратам. Особую тревогу вызывает рост числа штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (т.е. одновременно устойчивых к наиболее активным противотуберкулезным препаратам – изониазиду и рифампицину). Туберкулезный процесс, вызванный микобактериями, устойчивыми к данным препаратам, трудно поддается лечению и приводит к развитию хронических форм заболевания [Хоменко А.Г. и др., 1996].

Повсеместное распространение лекарственно-устойчивого туберкулеза требует пересмотра стандартных схем противотуберкулезной терапии. Для лечения больных туберкулезом наряду с препаратами первой линии (изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол, пиразинамид), все чаще применяют новые режимы химиотерапии с использованием препаратов второй линии (протионамид, канамицин, амикацин, капреомицин, циклосерин, рифабутин, ПАСК, офлоксацин). Для достижения эффективных результатов лечения необходимо знание спектра и уровня лекарственной устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к этим препаратам.

При оценке лекарственной устойчивости микобактерий учитывают критические концентрации противотуберкулезных препаратов. Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же лекарственного препарата может быть различна. Значения критических концентраций существенно отличаются и при использовании разных методов определения лекарственной устойчивости [Kim S.J., 2005]. В России для тестирования устойчивости микобактерий к химиопрепаратам традиционно используют метод абсолютных концентраций и плотную яичную питательную среду Левенштейна-Йенсена. В настоящее время используемые в данном методе критические концентрации противотуберкулезных препаратов первой линии определены, тогда как критические концентрации лекарственных препаратов второй линии для M. tuberculosis носят лишь рекомендательный характер и требуют дополнительных исследований с использованием современных клинических штаммов [Приказ № 109 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации" М., 2003 г.].

Известно, что при неадекватной химиотерапии в очаге поражения у больного туберкулезом создаются условия для селекции лекарственно-устойчивых микобактерий, что в значительной степени снижает эффективность лечения, увеличивает его стоимость, повышает риск смертельного исхода заболевания. Помимо этого, пациенты, страдающие лекарственно-устойчивым туберкулезом, являются потенциально опасными для окружающих. Поэтому определение спектра и степени устойчивости микобактерий к противотуберкулезным препаратам имеет большое значение для оптимизации тактики химиотерапии больных туберкулезом, контроля эффективности лечения, определения прогноза заболевания и проведения эпидемиологического мониторинга лекарственной устойчивости микобактерий.





Цель работы

Анализ устойчивости к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением заболевания, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации.

Задачи исследования

  1. Создать панель современных клинических штаммов M. tuberculosis, “предположительно” чувствительных и “предположительно” устойчивых к противотуберкулезным препаратам второй линии: канамицину, капреомицину и офлоксацину.
  2. Определить критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемые для оценки лекарственной устойчивости M. tuberculosis методами абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и пропорций на среде Middlebrook 7Н10.
  3. Провести мониторинг штаммов M. tuberculosis, полученных от больных с хронической формой туберкулёза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации, обратившихся за медицинской помощью в течение 2003-2005 гг., для определения устойчивости их к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.

Научная новизна работы

  1. Впервые определены критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций с использованием охарактеризованной микробиологическими и молекулярно-биологическими методами панели современных клинических штаммов M. tuberculosis.
  2. Проведен мониторинг устойчивости штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных хронической формой туберкулеза (Центральный и Приволжский регионы, 2003-2005 гг.), к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии.
  3. Методом ПЦР-секвенирования в гене pncA выявлены ранее не описанные мутации, детерминирующие устойчивость M. tuberculosis к пиразинамиду.

Практическое значение работы

Разработаны методические рекомендации "Определение критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина, используемых для оценки лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций на питательной среде Левенштейна-Йенсена". Данные рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательских институтах, проводящих работы по определению лекарственной устойчивости микроорганизмов и разрабатывающих новые методы ее тестирования; в бактериологических лабораториях фармацевтических производственных учреждений, выполняющих работы по определению противотуберкулезной активности лекарственных препаратов.

Разработан универсальный алгоритм, который может быть использован при определении критических концентраций других противотуберкулезных химиопрепаратов. Это особенно важно, так как существуют резервные препараты и ряд препаратов второй линии, для которых показатели критических концентраций остаются пока неизвестными, что ограничивает возможность их использования в клинической практике.

Проведена оценка вклада отдельных мутаций в формировании устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии. Полученные данные имеют существенное значение при разработке молекулярно-биологических диагностических систем. Информация о впервые выявленных мутациях в гене pncA внесена в базу данных генетических последовательностей (GenBank).

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов

M. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.

  1. Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели современных генетически гетерогенных клинических штаммов M. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций – 2 мкг/мл.
  2. Выявлено 15 новых мутаций в гене pncA детерминирующих устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31ACC, 49CAC, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-A-9, Ins 64-A-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.
  3. Среди штаммов M. tuberculosis, выделенных из мокроты больных с хронической формой туберкулеза легких (n=325), проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации в течение 2003-2005 гг., 62,5% штаммов устойчивы к изониазиду, 54,2% – к рифампицину, 61,8% – к стрептомицину, 37,2% – к этамбутолу, 30,5% – к пиразинамиду, 32,3% – к канамицину, 24,0% – к капреомицину и 7,7% – к офлоксацину.
  4. Установлено, что устойчивость штаммов M. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев – в гене rpoB, к стрептомицину в 52,7% случаев – в гене 16SrRNA и в 22,4% – в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев – в гене embB, к пиразинамиду в 100% случаев – в гене pncA, к канамицину в 87,6% случаев – в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев – в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев – в гене gyrA.

Апробация работы Результаты работы доложены на: 36-й Международной конференции "Здоровье легких" Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Париж, 2005), II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (Москва, 2005), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" (Москва, 2007), Проблемном симпозиуме по молекулярной и клеточной биологии "Патогенез и контроль распространения лекарственно-устойчивых организмов" (Бангкок, 2008), 5-м конгрессе Международного союза против туберкулеза и легочных заболеваний (Дубровник, 2009).

Публикации По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе три работы в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 171 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, приложений и списка литературы, включающего 100 работ отечественных и 119 работ зарубежных авторов. Работа содержит 14 рисунков и 15 таблиц.

Собственные исследования

Материалы и методы

В работе использованы штаммы M. tuberculosis, выделенные из мокроты больных хроническим туберкулезом легких. Штаммы получены из противотуберкулезных диспансеров городов Москва, Тула, Серпухов, Иваново и Нижний Новгород. Лабораторный референс-штамм M. tuberculosis H37Rv поступил из ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Референс-штамм M. bovis BCG получен из НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.

Принадлежность бактериальных культур к виду M. tuberculosis подтверждена культуральными и биохимическими методами согласно приказу № 109 от 21 марта 2003 г. ''О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации''. При идентификации микобактерий учитывали скорость роста, пигментацию и морфологию колоний, а так же способность к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 500-1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез М., 2001]. Ниациновый тест проводили согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Бараускене. Активность и термостабильность каталазы определяли по методике Kent P. T. et al., 1985. Для определения устойчивости микобактерий к пиразинамиду использовали тест на наличие пиразинамидазной активности. Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Приказ №558 ''Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе'' М., 1978]. Устойчивость к противотуберкулезным препаратам тестировали методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена и методом пропорций на среде Middlebrook 7Н10 [Приказ МЗ РФ № 109 М., 2003]. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) канамицина, капреомицина и офлоксацина определяли методом серийных разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7H10. Критические концентрации противотуберкулезных препаратов второй линии были установлены в результате анализа МПК препаратов, обработанных с помощью графических ресурсов программы Microsoft Office Excel 2003.

Для RFLP-IS6110-типирования M. tuberculosis использовали методику Van Embden J.D.A. et al., 1995. Компьютерный анализ полученных данных проводили методом UPGMA с помощью пакета программ GelCompar II (version 2.5, для Windows 98, Бельгия). Штаммы сполиготипировали по классической методике Kamerbeek J. et al., 1997.

Метод гибридизации на нуклеотидных биочипах использовали для выявления мутаций в гене rpoB, детерминирующих устойчивость микобактерий к рифампицину. ПЦР-секвенирование генов katG, rpoB, rpsL, 16SrRNA, embB, pncA, tlyA, gyrA и gyrB, обуславливающих устойчивость штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам, определяли при помощи автоматического секвенатора MegaBase 750. При поиске гомологии нуклеотидных последовательностей использовали программу Vector NTI ("InforMax", США).

Результаты исследования и их обсуждение

Создание панели клинических штаммов M. tuberculosis

Была сформирована стандартная панель современных клинических штаммов M. tuberculosis, включающая 24 "предположительно" чувствительных штаммов и 70 "предположительно" устойчивых к изучаемым лекарственным препаратам штаммов. "Предположительно" чувствительные культуры были выделены из мокроты больных, не принимавших изучаемый препарат, и не имеющих мутации в целевых генах M. tuberculosis. "Предположительно" устойчивые культуры выделены из мокроты больных, принимавших изучаемый препарат, и имеющих мутации в целевых генах M. tuberculosis.

Для исключения возможного изогенного происхождения клинические штаммы M. tuberculosis были тестированы методом сполиготипирования. Полученные данные представлены в виде восьмеричного кода и схематических профилей гибридизации в Табл 1.

Таблица 1

Сполиготипы клинических штаммов M. tuberculosis

Сполигограмма ( – наличие сигнала, – отсутствие сигнала при гибридизации) Сполигопаттерн (восьмеричный код) Сполиго- семейство Количество штаммов
000000000003771 Beijing 34
000000000003371 Beijing 1
000000000003171 Beijing 1
777477607760771 LAM9 27
407777607760771 LAM9 1
775741003760771 LAM 1
777457607760771 LAM 1
777777607760731 LAM4 1
777777777760771 T1 4
777740003760771 T1 1
777777737760571 T 1
777775077760771 T 1
777777377760771 T4 2
777760007760771 T5 RUS1 1
770000777760771 T1 RUS2 2
774777777420771 Haarlem4 4
610000777720771 Haarlem 1
774777717420771 Haarlem 1

774777177420771 Haarlem 1

777777777720771 Haarlem3 1

777477607763771 MANU2 3

777776777760771 X1 1

777777377560771 U 1

000002000003771 U 2

Примечание: U – сполигосемейство не идентифицировано

В результате исследования было выявлено 24 сполиготипа. Уникальный профиль гибридизации имели 17,02% (n=16) штаммов. Клинические штаммы с идентичными сполигопаттернами составили 82,98% (n=78).

Метод RFLP-IS6110-типирования позволяет произвести более тонкую дифференциацию микобактериальных штаммов чем сполиготипирование. Поэтому штаммы, имеющие одинаковые сполигопаттерны, были дополнительно протестированы этим методом. В результате RFLP-IS6110-типирования у 42 из 78 штаммов M. tuberculosis выявлен индивидуальный RFLP-IS6110 профиль. Для дальнейшей характеристики клональности штаммов микобактерий был использован подход, основанный на определении мутаций в генах katG, inhA, rpoB, rpsL и 16SrRNA. В результате ПЦР-секвенирования 36 штаммов у девяти из них обнаружены разные типы мутаций.

Таким образом, использование в работе молекулярно-биологических методов исследования позволило выявить генетическую гетерогенность для 71,3% (n=67) штаммов, включенных в стандартную панель.

Определение критических концентраций противотуберкулезных препаратов: канамицина, капреомицина и офлоксацина

Для этой работы использовали сформированную нами стандартную панель клинических штаммов М. tuberculosis, 24 из которых являются ''предположительно'' чувствительными, 23 – ''предположительно'' канамицин-устойчивыми, 28 – "предположительно" капреомицин-устойчивыми и 25 – "предположительно" офлоксацин-устойчивыми.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов для метода абсолютных концентраций были определены в результате математического анализа минимальных подавляющих концентраций препаратов, выявленных методом серийных разведений на среде Левенштейна-Йенсена. Результаты определения МПК лекарственных препаратов представлены в Табл. 2-4 и в виде диаграмм (рис. 1).

Таблица 2

Определение МПК канамицина для штаммов М. tuberculosis

Концентрация канамицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных канамицином Концентрация канамицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных канамицином
0,469 1 30,0 0
0,938 2 60,0 0
1,875 0 120,0 2
3,75 3 240,0 1
7,5* 10 480,0 0
15,0 8 960,0 0
30,0 1 3840,0 20

Таблица 3

Определение МПК капреомицина для штаммов М. tuberculosis

Концентрация капреомицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных капреомицином Концентрация капреомицина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных капреомицином
30,0 2 30,0 0
15,0* 18 60,0 2
7,5 3 120,0 10
3,75 1 240,0 15
1,88 0 480, 1
0,94 0 960, 0
0,47 0 1 920,0 0

Таблица 4

Определение МПК офлоксацина для штаммов М. tuberculosis

Концентрация офлоксацина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, не леченных офлоксацином Концентрация офлоксацина (мкг/мл) Количество штаммов, выделенных от больных, леченных офлоксацином
0,03 0 2,0 0
0,06 0 4,0 1
0,125 2 8,0 9
0,25 1 16,0 8
0,5 4 32,0 4
1,0 15 64,0 3
2,0* 3 128,0 0

Примечание: * – концентрация, которая соответствует МПК лекарственного препарата для штамма М. tuberculosis H37Rv

а) б)

Рис. 1. Определение критической концентрации канамицина

а) б)

Рис. 2. Определение критической концентрации капреомицина

а) б)

Рис. 3. Определение критической концентрации офлоксацина

Примечание: а – метод абсолютных концентраций, б – метод пропорций

На диаграммах значения, отложенные на оси Y, соответствуют проценту штаммов с данным значением МПК из полной выборки клинических штаммов, использованных в работе.

Согласно данным, полученным при анализе значений МПК противотуберкулезных препаратов, установлено, что критические концентрации канамицина и капреомицина для метода абсолютных концентраций равны 50 мкг/мл. Для офлоксацина этот показатель равен 3 мкг/мл.

Для подтверждения корректности использованного нами алгоритма исследования были определены критические концентрации изучаемых лекарственных препаратов для метода пропорций на питательной среде Middlebrook 7Н10 с использованием того же подхода и той же панели штаммов. Критические концентрации канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода пропорций оказались равными 5, 10 и 2 мкг/мл, соответственно. Именно эти концентрации антибиотиков используются для определения лекарственной чувствительности методом пропорций, в частности в Центре по контролю за заболеваниями (США), Национальном Центре микробиологии (Швейцария). Распределение МПК "предположительно" лекарственно-чувствительных и "предположительно" лекарственно-устойчивых штаммов, установленных методом серийных разведений на средах Левенштейна-Йенсена и Middlebrook 7Н10, имели общую закономерность (рис. 1). При анализе результатов определения устойчивости к канамицину, капреомицину и офлоксацину большой выборки клинических штаммов M. tuberculosis методами абсолютных концентраций с использованием установленных нами значений критических концентраций препаратов и пропорций показано, что результаты тестирования совпали в 100% случаев.

Установленные значения критических концентраций канамицина, капреомицина и офлоксацина для метода абсолютных концентраций мы использовали при оценке лекарственной устойчивости 325 клинических штаммов М. tuberculosis.

Определение устойчивости клинических штаммов M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам первой и второй линии методами абсолютных концентраций и пропорций

Устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к изониазиду, рифампицину, стрептомицину, этамбутолу, канамицину, капреомицину и офлоксацину определяли методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Для оценки устойчивости клинических штаммов к пиразинамиду использовали тест на наличие пиразинамидазной активности.

Установлено, что 33,54% (n=109) штаммов являются лекарственно-чувствительными. Устойчивость к одному из изучаемых противотуберкулезных препаратов обнаружена у 10,77% (n=35) штаммов. Количество полирезистентных штаммов, т.е. устойчивых к любым двум и более противотуберкулезным препаратам без одновременной устойчивости к изониазиду и рифампицину равно 10,15% (n=33). Уровень МЛУ штаммов составил 45,54% (n=148). Устойчивость к изониазиду наблюдалась в 62,46% случаев (n=203), к стрептомицину – в 61,85% (n=201), к рифампицину – в 54,15% (n=176), к этамбутолу – в 37,23% (n=121), к канамицину – в 32,31% (n=105), пиразинамиду – в 30,46% (n=99), к капреомицину – в 24,0% (n=78), к офлоксацину – в 7,69% (n=25). Результаты представлены на Рис 4.

Рис. 4. Лекарственная устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis

Примечание: INH – изониазид, STR – стрептомицин, RIF – рифампицин, EMB – этамбутол, PZA – пиразинамид, KAN – канамицин, CAP – капреомицин, OFL – офлоксацин

ПЦР-секвенирование генов, мутации в которых детерминируют устойчивость к противотуберкулезным препаратам

Формирование антибиотико-устойчивости у микобактерий в подавляющем числе случаев связано с накоплением хромосомных мутаций в генах, кодирующих мишени действия препаратов. Наиболее информативным методом, позволяющим максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности, является ПЦР-секвенирование. Поэтому для определения мутаций, детерминирующих устойчивость штаммов к противотуберкулезным препаратам, использовали данный метод. Результаты представлены в Табл. 5.

Таблица 5

Генетические мутации, ассоциированные с лекарственной устойчивостью

клинических штаммов M. tuberculosis

Ген Номер позиции (кодон) и нуклеотидная замена Замена аминокислот Количество штаммов
katG 315AGCACC SerThr 184
315AGCACG SerThr 2
315AGCAGA SerArg 1
rpoB 516GACGTC AspVal 87
531TCGTTG SerLeu 37
516GACTAC AspTyr 11
526CACGAC HisAsp 9
526CACTAC HisTyr 7
511CTGCCG LeuPro 3
522TCGCAG SerGln 2
531TCGTGG SerTrp 1
rpsL 43AAGAGG LysArg 41
88AAGAGG LysArg 4
16SrRNA (427-980) 513AC 94
516CT 9
515CT 2
514GT 1
embB 306ATGATA MetIle 64
306ATGGTG MetVal 11
406GGCGAC GlyAsp 8
306ATGATT MetIle 3
306ATGATC MetIle 2
406GGCGCC GlyAla 2
406GGCAGC GlySer 1
16SrRNA (1288-1543) 1400АG 88
1401СТ 4
tlyA Del 23 GCC 1
gyrA 94GACGGC+95AGCACC AspGly, SerThr 17
90GCGGTG+95AGCACC AlaVal, SerThr 7

Для определения устойчивости клинических штаммов к рифампицину дополнительно использовали метод гибридизации на олигонуклеотидных биочипах “ТБ-биочип (РИФ)”, поскольку данный метод считается перспективным для тестирования лекарственной чувствительности штаммов M. tuberculosis в клинической практике [Михайлович В.М. и др., 2001, Caoili J. C. et al., 2006].

Из 325 клинических штаммов M. tuberculosis 189 штаммов были протестированы методом гибридизации на биочипах. При анализе мутаций, детерминирующих устойчивость M. tuberculosis к рифампицину, этим методом были получены результаты, совпадающие с результатами ПЦР-секвенирования в 98,40% случаев (табл. 6).

Таблица 6

Данные ПЦР-секвенирования и гибридизации на биочипах гена rpoB

для 189 клинических штаммов M. tuberculosis

Номер позиции и кодон Количество штаммов, шт. Интерпретация результатов определения лекарственной чувствительности: секвенирования//гибридизации на чипах
Данные ПЦР-секвенирования гена rpoB Данные гибридизации на чипах
516GTC 516Val 87 устойчивый//устойчивый
531TTG 531Leu 37 устойчивый//устойчивый
526GAC 526Asp 9 устойчивый//устойчивый
526TAC 526Tyr 7 устойчивый//устойчивый
516TAC 516Tyr 11 устойчивый//устойчивый
511CCG 511Pro 3 устойчивый//устойчивый
522CAG ND 2 устойчивый// не определена чувствительность
531TGG 531Trp 1 устойчивый//устойчивый
WT LD 1 чувствительный// не определена чувствительность
WT WT 31 чувствительный // чувствительный

Примечание: LD – низкая дискриминация, ND – нет данных, WT – дикий тип

У пиразинамид-устойчивых штаммов M. tuberculosis методом ПЦР-секвенирования выявлено 44 типа мутаций, локализованных в 28 кодонах гена pncA (табл. 7).

Таблица 7

ПЦР-секвенирование гена pncA штаммов M. tuberculosis

Замена нуклеотидов Замена аминокислот Количество штаммов
-11 AG 6
1 ATGACG MetThr 1
4 TTGTCG LeuSer 3
4 TTGTGG LeuTrp 1
6 ATCCTC IleLeu 2
8 GACGAG AspGlu 1
8 GACGGC AspGly 2
12 GACGCC AspAla 3
12 GACGGC AspGly 2
19 CTGCCG LeuPro 4
27 CTGCCG LeuPro 2
31 ATCACC IleThr 1
31 ATCAGC IleSer 1
41 TACTAA TyrTer 1
49 GACCAC AspHis 1
57 CACCAG HisGln 6
57 CACCGC HisArg 7
62 CCGCTG ProLeu 1
63 GACGAA AspGlu 7
63 GACGCC AspAla 1
73 GTCGGC ValGly 1
76 ACTCCT ThrPro 1
85 CTGCCG LeuPro 1
96 AAGAGG LysArg 1
97 GGTAGT GlySer 4
97 GGTGAT GlyAsp 4
103 TACTAG TyrTer 7
105 GGCGAC GlyAsp 1
119 TGGCGG TrpArg 1
130 GTGGAG LeuGlu 1
132 GGTGAT GlyAsp 1
139 GTGGCG ValAla 1
141 CAGCCG GlnPro 3
160 ACACCA ThrPro 2
171 GCGGTG AlaVal 1
175 ATGAGG MetArg 1
175 ATGATA MetIle 3
Ins 8-9GACAGTG 1
Ins 64-65TATATCC 3
Ins 86GAGAC 1
Ins 130GTGGG 2
Ins 176-177CGCACCGACC 2
Del 40-45 GACTACCATCACGTCGT 2
Del 151-153TTGGCCACC 1

Примечание: Жирным шрифтом выделены инсерции (Ins) и делеции (Del)

Ранее описанные аминокислотные замены, приводящие к развитию устойчивости к пиразинамиду, определены нами у 65,66% (n=65) штаммов. У 34,34% (n=34) штаммов M. tuberculosis обнаружено 17 новых мутаций.

Семнадцать штаммов, у которых определены новые нуклеотидные замены, были проверены на устойчивость к пиразинамиду при помощи автоматизированной системы Bactec MGIT 960 (табл. 8).

Таблица 8

Устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к пиразинамиду,

наличие пиразинамидазной активности и мутаций в гене pncA

Пиразинамидазная активность Мутации в гене pncA (номер кодона и замена) Чувствительность к PZA, определенная методом BACTEC 960 MGIT
1 отсутствует 6 ATCCTC нет данных
2 отсутствует 12 GACGGC устойчивый
3 отсутствует 31 ATCAGC устойчивый
4 отсутствует 31 ATCACC устойчивый
5 отсутствует 49 GACCAC устойчивый
6 отсутствует 57 CACCAG устойчивый
7 отсутствует 57 CACCGC устойчивый
8 отсутствует 73 GTCGGC устойчивый
9 отсутствует 105 GGCGAC устойчивый
10 отсутствует 130 GTGGAG устойчивый
11 отсутствует 175 ATGATA чувствительный
12 отсутствует Ins 8-9GACAGTGк устойчивый
13 отсутствует Ins 64-65TATATCC устойчивый
14 отсутствует Ins 86GAGAC устойчивый
15 отсутствует Ins 176-177CGCACCGACC устойчивый
16 отсутствует Del 40-45 GACTACCATCACGTCGTG устойчивый
17 отсутствует Del 151-153TTGGCCACC устойчивый

Примечание: Жирным шрифтом выделены инсерции (Ins) и делеции (Del)

Устойчивость к пиразинамиду выявлена у 15 из 17 клинических штаммов. В одном случае не удалось определить лекарственную чувствительность в системе Bactec MGIT 960 в связи с плохим ростом микобактерий. Для одного штамма обнаружено несовпадение результатов определения пиразинамидазной активности и результатов определения устойчивости штамма к пиразинамиду методом Bactec MGIT 960.

ВЫВОДЫ

  1. Критические концентрации канамицина и капреомицина, определенные для метода абсолютных концентраций с использованием панели генетически гетерогенных клинических штаммов M. tuberculosis, равны 50 мкг/мл.
  2. Критическая концентрация офлоксацина, определенная для метода абсолютных концентраций с использованием панели генетически гетерогенных клинических штаммов M. tuberculosis, равна 3 мкг/мл, для метода пропорций – 2 мкг/мл.
  3. Выявлено 15 новых мутаций в гене pncA, детерминирующих устойчивость клинических штаммов M. tuberculosis к пиразинамиду: 12GGC, 31AGC, 31ACC, 49CAC, 57CAG, 57CGC, 73GGC, 105GAC, 130GAG, Ins 8-A-9, Ins 64-A-65, Ins 86GA-GA-C, Ins 176-ACCG-177, Del 40-45_TG, Del 151-153TT_CC.
  4. Обнаружено, что среди клинических штаммов M. tuberculosis, выделенных от больных с хронической формой туберкулеза легких, проживающих в Центральном и Приволжском регионах Российской Федерации (2003-2005 гг.), устойчивость к изониазиду составляет 62,5%, к рифампицину – 54,2%, к стрептомицину – 61,8%, к этамбутолу – 37,2%, к пиразинамиду – 30,5%. к канамицину – в 32,3%, к капреомицину – в 24,0%, к офлоксацину – в 7,7%.
  5. Установлено, что устойчивость штаммов M. tuberculosis к изониазиду в 92,1% случаев обусловлена мутациями в гене katG, к рифампицину в 89,2% случаев – в гене rpoB, к стрептомицину в 52,7% случаев – в гене 16SrRNA и в 22,4% – в гене rpsL, к этамбутолу в 75,2% случаев – в гене embB, к пиразинамиду в 100% случаев – в гене pncA, к канамицину в 87,6% случаев – в гене 16SrRNA, к капреомицину в 1,3% случаев – в гене tlyA, к офлоксацину в 96,0% случаев – в гене gyrA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Lipin M.Y., Ivanov I.Y., Nizova A.V., Blagodatskikh S.A. The distribution of families of drug-resistant mycobacterium // 26th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology. Abstract Book. – Istanbul, – 2005. – P. 35.
  2. Shemyakin I.G., Stepanshina V.N., Lipin M.Y., Ivanov I.Y., Nizova A.V. Molecular Characteristics of LAM/A1 Lineage of Mycobacterium tuberculosis // 36th World Conference on Lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease (The Union). Abstract Book. – France. – 2005. – P. 119.
  3. Степаншина В.Н., Шемякин И.Г., Липин М.Ю., Иванов И.Ю., Низова А.В. A1/LAM семейство Mycobacterium tuberculosis. // Тез. докл. II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". – 2005. – М., –2005. – С. 263.
  4. Степаншина В.Н., Липин М.Ю., Иванов И.Ю., Низова А.В., Благодатских С.А., Шемякин И.Г. Распределение лекарственно-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis, относящихся к различным генетическим семействам, является регион-зависимым в Центральной части России. // Тез. докл. II Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность". – 2005. – М., –2005. – С. 264.
  5. Шемякин И.Г., Степаншина В.Н., Низова А.В., Благодатских С.А. Распределение лекарственно-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis в Центральной части России // Тез. докл. Международной конференции "Биологические мишени для действия лекарственных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию". – Химки, – 2006. – С. 30.
  6. Благодатских С.А., Степаншина В.Н., Низова А.В., Шемякин И.Г. Социальный портрет больных туберкулезом легких в городе Тула // Тез. докл. Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств". – Оболенск, – 2006. – С. 18.
  7. Низова А.В., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Определение чувствительности клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к изониазиду методом Деплиторной Аллель-Специфической ПЦР // Тез. докл. Межгосударственной научно-практической конференции "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств". – Оболенск, – 2006. – С. 116.
  8. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Богун А.Г., Майорова А.А., Шемякин И.Г. Анализ устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда // Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2007. – № 4. – С. 7-11.
  9. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майорова А.А., Майская Н.В., Благодатских С.А., Мухина Т.Н., Шемякин И.Г. Анализ результатов определения чувствительности к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis микробиологическими и молекулярно-биологическими методами // Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" – М., – 2007. – Т.3. – С. 39-40.
  10. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майорова А.А., Майская Н.В., Шемякин И.Г., Борисов С.Е., Смирнова Н.С., Попов С.А. Определение чувствительности к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis в образцах мокроты методами гибридизации на биочипах и Bactec 960 // Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" – М., – 2007. – Т.3. – С. 41-42.
  11. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis// Тез. докл. VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Молекулярная диагностика" – М., – 2007. – Т.3. – С. 43-44.
  12. Степаншина В.Н., Низова А.В., Майорова А.А., Липин Ю.М., Майская Н.В., Шемякин И.Г., Борисов С.Е., Смирнова Н.С., Попов С.А. Определение чувствительности к рифампицину клинических штаммов M. tuberculosis с помощью микробиологических и молекулярно-биологических методов// Биотехнология. – 2008. – № 1. – С. 83-91.
  13. Dubiley S., Stepanshina V., Nizova A., Blagodatsky S., Moukhina T., Shemyakin I. Molecular epidemiology and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis strains in Central Russia // Pathogenesis and Control of Emerging and Drug-Resistant Organisms. Abstract Book. – Bangkok, – 2008. – P. 68.
  14. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду // Молекулярная генетика, Микробиология и Вирусология. – 2008. – № 4. – С. 23-26.
  15. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская В.Н., Миронова Р.И., Мухина Т.Н. Шемякин И.Г. Определение устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" – Оболенск, – 2009. – С. 246-248.
  16. Низова А.В., Степаншина В.Н., Миронова Р.И., Мухина Т.Н., Николаева О.Н., Благодатских С.А., Майская Н.В., Шемякин И.Г. Определение критической концентрации канамицина для Mycobacterium tuberculosis методом абсолютных концентраций // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" – Оболенск, – 2009. – С. 248-249.
  17. Мухина Т.Н., Степаншина В.Н., Миронова Р.И., Низова А.В., Шемякин И.Г. Характеристика лекарственной устойчивости штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от впервые выявленных больных туберкулезом легких // Тез. докл Научно-практической конференции СМУиС Роспотребнадзора "Биологическая безопасность в современном мире" – Оболенск, – 2009. – С. 244-245.
  18. Stepanshina V., Popov S., Aparina N., Mironova R., Mukhina T., Nizova A., Maiskaya N., Nikolaieva O., Bogun A., Blagodatskikh S., Shemyakin I., Cegielski P. MGIT BACTEC 960 – based determination of kanamycin critical concentration for Mycobacterium tuberculosis // 5th Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Abstract Book. – Dubrovnik, – 2009. – P. 88.


 


Похожие работы:

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»







Загрузка...



 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.