WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Конструирование аттенуированных штаммов yersinia  pestis с пониженной реактогенностью

На правах рукописи

АГЕЕВ

Сергей Андреевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS

С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ

03.02.03– микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск – 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук Дентовская Светлана Владимировна

Доктор медицинских наук, профессор Анисимов Андрей Павлович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Жемчугов Владислав Евгеньевич

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится «20» октября 2010 года в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФГУН ГНЦ ПМБ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «20» сентября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы:

За двести лет своего существования вакцинология достигла поразительных успехов - возбудитель оспы сохранился только в коллекциях двух лабораторий, заболеваемость целым рядом инфекций (полиомиелит, дифтерия и др.) удалось снизить до такой степени, что можно также надеяться на их полное искоренение, а сотни опаснейших болезней взяты здравоохранением под контроль благодаря классическим вакцинам, полученным методами инактивации и аттенуации. Способы получения вакцин с тех пор значительно изменились. Сегодня развитие методов молекулярной биологии, генной медицины, органической химии и иммунологии позволяют выделять очищенные нативные и получать синтетические антигены, направленно конструировать продуценты рекомбинантных протективных антигенов с заданными свойствами на основе технологичных штаммов бактерий или высших растений ("съедобные вакцины") и прецизионно аттенуированные мутанты и живые векторы на основе бактерий и вирусов, экспрессирующих протективные антигены in situ; использовать ДНК, РНК и полисахариды для индукции запрограммированного релевантного иммунного ответа [Медуницын Н.В. 1997; Levine, Sztein, 2004; Stanley, Plotkin, 2005].

Основные требования, предъявляемые к современным вакцинным препаратам, включают: безупречный уровень безопасности для всех слоев населения, в том числе лиц с измененной иммунной реактивностью (младенцы, беременные, пожилые, лица с нарушениями иммунного статуса); создание напряженного и долгосрочного уровня защиты, развивающегося не позднее чем через 2-3 недели после однократного введения вакцинного препарата; безинъекционный способ введения в организм (через рот, нос, слизистые); возможность комбинирования с другими вакцинами; устойчивость к внешним воздействиям и отсутствие специальных требований для хранения; и, наконец, экономичность и простоту изготовления [Levine, Sztein, 2004]. Однако до сих пор не существует “идеальной вакцины”, полностью соответствующей всем перечисленным требованиям. Большинство вакцинных препаратов обладает лишь частью из этих характеристик, и каждый из них имеет свои недостатки и ограничения.

В последние годы наибольшее внимание в разработке препаратов для вакцинопрофилактики чумы уделяется созданию субъединичных вакцин, содержащих лишь протективные антигены и неспособных вызывать инфекционный процесс даже у лиц с нарушениями иммунного статуса. Однако и они не являются идеальными, т.к. слабо индуцируют клеточное звено иммунитета и не могут предохранять от гибели после заражения штаммами, полностью утратившими способность к продукции антигена, используемого для иммунизации, либо продуцирующими серовары антигена, нераспознаваемые поствакцинальным иммунитетом. Так, чумные субъединичные вакцины на основе капсульного антигена F1 не способны стимулировать формирование напряженного поствакцинального иммунитета в отношении вирулентных бескапсульных штаммов Y. pestis, а препараты на основе V антигена неэффективны в отношении штаммов, продуцирующих серологически отличающиеся варианты белка [Anisimov et al., 2004]. В тоже время, применяемая в настоящее время в странах СНГ чумная живая вакцина на основе аттенуированного G. Girard'ом и J. Robic'ом в начале 30-х годов прошлого столетия [Girard, 1963] штамма Y. pestis EV лишена этих недостатков – она не только стимулирует напряженный и эффективный поствакцинальный иммунитет, но и предохраняет от гибели после заражения атипичными вариантами возбудителя чумы за счет индукции иммунного ответа на целый ряд антигенов, расположенных на клеточной поверхности как типичных, так и измененных бактерий [Анисимов, 1999]. Однако следует признать, что на настоящий момент эта вакцина морально устарела, прежде всего, из-за ее высокой реактогенности и способности вызывать тяжелые местные и системные реакции у здоровых вакцинируемых и даже генерализованный инфекционный процесс у лиц со сниженным иммунным статусом [Наумов и др., 1992; Meyer et al., 1974а; Perry, Fetherston, 1997]. Поэтому снижение реактогенности живой чумной вакцины является одной из важных задач современной системы противочумной защиты населения.





Сотрудниками ФГУН ГНЦ ПМБ были сконструированы мутанты вакцинного штамма EV с нарушенным синтезом лауриновой кислоты, в которых центральная часть гена lpxM была замещена геном, определяющим устойчивость к канамицину [Anisimov et al., 2007]. В серии экспериментов на мышах [Anisimov et al., 2007; Feodorova et al., 2007] и морских свинках [Feodorova et al., 2007] было установлено, что lpxM мутант по сравнению с исходным вакцинным штаммом не только снизил реактогенность, но и обладал повышенной иммуногенностью. Однако использование такого штамма в качестве основы для живой вакцины недопустимо из-за присутствия в его геноме гена лекарственной устойчивости. Конструирование lpxM мутанта вакцинного штамма EV, лишенного маркеров лекарственной устойчивости, позволит получить кандидат в вакцинные штаммы Y. pestis - основу для разработки новой живой чумной вакцины со сниженной реактогенностью и повышенной иммуногенностью.

Цель исследования – разработка способа конструирования кандидатов в вакцинные штаммы чумного микроба с пониженной эндотоксической активностью: получение lpxM производных вакцинного штамма EV линии НИИЭГ и оценка их в качестве кандидатов в новые вакцинные штаммы.

Задачи исследования:

  1. Разработать способ конструирования lpxM мутантов Y. pestis, лишенных маркеров лекарственной устойчивости, и получить lpxM вариант вакцинного штамма EV линии НИИЭГ.
  2. Подтвердить корректность введенной мутации с помощью секвенирования сконструированной аллели гена lpxM и определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом.
  3. Провести сравнительную комплексную оценку эндотоксических свойств препаратов ЛПС, синтезируемых родительским и мутантным штаммами.
  4. Оценить биологические свойства кандидата в вакцинные штаммы, включая реактогеннось, безвредность и иммуногенную активность, в соответствии с методическими указаниями МУ 3.3.1.1113-02 "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба".

Научная новизна.

Впервые сконструирован и охарактеризован в соответствии с методическими указаниями "Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба" [2002] lpxM вариант вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости. Установлено, что степень снижения токсичности ЛПС Y. pestis, утратившего шестой жирно-кислотный остаток, зависит от видовой принадлежности клеток – мишеней макроорганизма. Выявлено антагонистическое действие мутантного пентаацильного ЛПС по отношению к ЛПС дикого типа на модели человеческих, но не мышиных фагоцитирующих клеток. Впервые показано, что повышение иммуногенности штамма может сопровождаться снижением его “остаточной вирулентности”

Практическая значимость и внедрение результатов работы.

Разработана методология направленного конструирования лишенных маркеров антибиотикоустойчивости неревертирующих lpxM мутантов Y. pestis, сочетающая прямой сайт-направленный мутагенез по методике K.A. Datsenko и B.L. Wanner [2000], клонирование мутантной аллели lpxM::cat в суицидном векторе pCVD442, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику. В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонированы: штамм E. coli DH5- pir/pCVD442-lpxM::cat (рег. номер В-6512), продуцирующий суицидный вектор pCVD442-lpxM::cat, штамм E. coli S17- pir/pCVD442-lpxM::cat (рег. номер В-6511), предназначенный для конъюгативной передачи суицидного вектора в штаммы чумного микроба. Причем сконструированный штамм может использоваться как донор при создании новых кандидатов в вакцинные штаммы на основе любых аттенуированных штаммов Y. pestis.

В коллекции живых культур ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» депонирован авторский штамм Y. pestis EVlpxM (рег. номер В-6513), сочетающий делецию гена lpxM с отсутствием маркеров лекарственной устойчивости (федеральный уровень внедрения).

Результаты исследований послужили основой для составления методических рекомендаций по изучению ингибирующего действия препаратов модифицированного ЛПС Y. pestis на индукцию синтеза TNF- эукариотическими клетками. (Оболенск, 2010, учрежденческий уровень внедрения).

Материалы диссертации используются в лекциях для магистрантов факультета биологической и экологической безопасности Пущинского государственного университета (учрежденческий уровень внедрения).

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный комплекс методических приемов, препаратов ДНК и бактериальных штаммов обеспечивает контролируемое конструирование лишенных маркеров лекарственной устойчивости lpxM мутантов Y. pestis – кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью.

2. Созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-. Снижение провоспалительной активности его ЛПС проявляется в большей степени на моноцитах человека и в меньшей степени на макрофагах мыши.

3. Уменьшение реактогенности (остаточной вирулентности) штамма Y. pestis EVlpxM сопровождается повышением его иммуногенности.

Работа выполнена в лаборатории микробиологии чумы (ЛМЧ) ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 124-Д от 11.06.2009 г. и № 52-Д от 29.06.2010 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 годы)».

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на: 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms – Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (Eilat, Israel, October 25-29, 2009,); VI-й Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10 – 11 ноября 2009); Научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010); Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФГУН ГНЦ ПМБ 8 сентября 2010 года.

Публикации. Основное содержание работы отражено в 8 научных публикациях (включая 2 статьи в международных научных журналах реферируемых ISI и 1 главу в международной монографии) список которых приведен в конце автореферата.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 42 работу отечественных и 173 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 12 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

В работе использовали четыре авирулентных штамма Y. pestis и один вирулентный штамм Y. pestis ssp. pestis 231, а также штаммы E. coli: DH5 pir, S17 pir, S17 pir/pCVD442 для проведения генетических манипуляций (МЖК ГНЦ ПМБ). Выращивание штаммов E. coli проводили на жидких и плотных питательных средах Луриа-Бертани (LB) при температуре 37 °С [Miller, 1972]. Клетки Y. pestis для мутагенеза растили на жидких и плотных питательных средах Хоттингера pH 7,2 -7,4 при 28 °С. Для выделения ЛПС штаммы Y. pestis выращивали с аэрацией при температуре 25 °C в ферментере «New Brunswick Scientific» в жидкой среде на основе солянокислого гидролизата казеина и дрожжевого автолизата.





Конструирование нокаутных мутантов по гену lpxM штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ проводили с помощью прямого сайт-направленного мутагенеза по методике K.A. Datsenko, B.L. Wanner, [2000]. Мутантную аллель lpxM::cat клонировали в суицидный вектор pCVD442, предварительно гидролизованный SmaI. Для удаления кассеты антибиотикоустойчивости использовали плазмиду pCP20.

Рестрикционно-лигазные работы выполняли по руководству T. Maniatis et al. [1982]. Передачу рекомбинантных плазмид в штаммы E. coli осуществляли “кальциевым” методом трансформации по S.N. Соhen и A.C.Y. Chang [1973], а в клетки Y. pestis - методом электростимулируемой трансформации [Еремин и др., 1991] и конъюгации [Miller, 1972]

Для определения нуклеотидной последовательности участка хромосомы lpxM штамма Y. pestis EVlpxM использовали прямой метод секвенирования без предварительного клонирования геномных фрагментов ДНК.

Выделение ЛПС проводили методом экстракции по C. Galanos [1969]. Электрофоретический контроль препаратов ЛПС проводили по U. Laemmli [1970] и О. Остерману [1985]. Для визуализации ЛПС гели окрашивали аммиачным раствором оксида серебра после окисления йодной кислотой в соответствии с рекомендациями C. Tsai и C. Frash [1982]. Концентрацию белковых примесей определяли по M. Bradford [1976] или O. Lowry [1951]. Содержание нуклеиновых кислот определяли спектрометрически, измеряя оптическую плотность при 260 нм [Wetmur J. Davidson N., 1968], и по окрашиванию препаратов бромистым этидием при электрофоретическом разделении в 0,7 % агарозном геле [Sharp et al., 1973].

Определение структуры полученных препаратов ЛПС проводили с использованием методов спектроскопии ядерно-магнитного резонанса (ЯРМ) и масс-спектрометрии (МС).

Для определения значений LD50 изучаемых препаратов ЛПС использовали 8-10 недельных мышей линий Balb/C. Животным вводили подкожно пятикратные разведения препаратов ЛПС, растворенных в апирогенном 0,9 % растворе NaCl. Для повышения чувствительности к ЛПС мышей сенсибилизировали подкожным введением раствора актиномицина Д в дозе 10 мкг/мышь одновременно с введением ЛПС.

Основные фенотипические характеристики, культуральные и морфологические свойства вакцинных штаммов Y. pestis определяли в соответствии с методическими указаниями “Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба” [2002].

Оценку TNF--индуцирующей активности ЛПС проводили in vitro и in vivo. В качестве клеток мишеней использовали клетки разной видовой принадлежности: линию мышиных макрофагов J774A.1, перитонеальные макрофаги мыши, линию человеческих промиелоцитов U937, моноциты периферической крови человека. В экспериментах in vivo определяли количество TNF- в сыворотке крови мышей Balb/C, сенсибилизированных актиномицином Д. Доза ЛПС составляла 50 мкг/мышь. Количество TNF- в клеточном супернатанте или в сыворотке крови мышей определяли иммуноферментным методом с использованием наборов фирмы Bender MedSystems.

Иммуноблотинг проводили по методу H. Towbin [1979]. Иммунохимическую активность сывороток тестировали методом твердофазного ИФА согласно руководству Т.Т. Нго с соавт. [1988].

Для определения уровня обсемененности органов у мышей линии Balb/C, инфицированных подкожно штаммами Y. pestis в дозе 107 КОЕ/мышь, проводили некропсию, забирали лимфатические узлы в месте введения и отдаленные лимфоузлы, селезенку, печень, легкие и головной мозг. Органы взвешивали и гомогенизировали, а затем десятикратные разведения гомогенатов высевали на агар Хоттингера. Через 48 ч подсчитывали количество колоний и проводили расчет обсемененности на орган.

Для сравнительной оценки иммуногенности клонов Y. pestis EVlpxM использовали «феномен переживания», описанный Н.Н. Гинсбургом [Гинсбург, 1969] в модификации Г.А. Апарина и Т.И. Вершининой [1986].

Определение безвредности, иммуногенной и протективной активности экспериментальных вакцинных штаммов проводили в соответствии с методическими указаниями «Основные критерии отбора вакцинных штаммов чумного микроба» [2002].

Для определения эффективной иммунизирующей дозы (ЕD50) вакцинных штаммов группы беспородных мышей и мышей линии Balb/c (по 10 животных в каждой) иммунизировали подкожно в область верхней трети правого бедра дозами 2  102, 1  103, 5  103 и 2,5  104 м.к. Y. pestis EVlpxM или Y. pestis EV линии НИИЭГ в 0,2 мл 0,9 %-ого физиологического раствора. Заражение животных проводили на 21-е сутки после иммунизации подкожно в область верхней трети левого бедра вирулентным штаммом Y. pestis 231 в дозе, соответствующей 200 DCL (1 Dcl = 10 КОЕ) выращенным на агаре Хоттингера при 28 °C в течение 48 ч. Величину ЕD50 исследуемого вакцинного штамма вычисляют по методу Krber, описанному И.П. Ашмариным и А.А. Воробьевым [1962].

Напряженность противочумного иммунитета (индекс иммунитета - ИИ) определяли по величине заражающей дозы, выраженной в LD50 вирулентного штамма для интактных животных, при заражении которой на 21-е сутки выживает не менее 50 % животных.

Результаты исследований.

Учитывая, что одним из возможных путей уменьшения реактогенности живой вакцины является генно-инженерная модификация ЛПС, обеспечивающая образование молекул со сниженной токсичностью [Дентовская С.В. с соавт., 2006], был получен мутантный по гену lpxM штамм на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ.

Конструирование LpxM варианта штамма Y. pestis EV заключалось в инактивации гена lpxM с помощью замены его на кассету устойчивости к антибиотику и последующем удалением кассеты из хромосомы (рис.1).

Рисунок 1. Схема конструирования LpxM варианта штамма Y. pestis EV

Методом одноэтапной инактивации хромосомных генов с помощью ПЦР-продуктов [Datsenko, Wanner, 2000] на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ был получен мутант, в котором кодирующая последовательность гена lpxM была заменена на кассету устойчивости к хлорамфениколу.

Для получения ПЦР-продукта, представляющего собой ген cat, ограниченный FRT сайтами и фланкированный с двух сторон короткими участками гомологии (55 п.н.) гена lpxM, в качестве матрицы в ПЦР была использована плазмида pKD3 с праймерами Cat1-f и Cat2-r. После введения в родительский штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ, предварительно трансформированный хелперной плазмидой pKD46, 100 нг ПЦР-продукта было получено 11 CmRApR колоний. Полученный штамм Y. pestis EVlpxM::cat/pKD46 был использован далее для клонирования инактивированного гена lpxM. Участок lpxM::cat амплифицировали с праймерами Cat3-f и Cat4-r. Затем на основе суицидного вектора pCVD442 была создана рекомбинантная плазмида pCVD442-lpxM::cat (рис. 2) и клонирована в штамме E. coli DH5 pir, а затем в штамме E. coli S17-1 pir, для ее последующего конъюгативного переноса в штамм Y. pestis EV.

Рисунок 2. Рекомбинантная плазмида pCVD442-lpxM::cat

После гомологичной рекомбинации проводили элиминирование интегрированного суицидного вектора и селективный отбор клонов Y. pestis EV НИИЭГ с инактивированным геном и кассетой антибиотикоустойчивости на агаре Хоттингера в присутствии 5 % сахарозы. Было получено восемь ApSCmRSucR колоний, которые верифицировали методом ПЦР с локус-специфичными праймерами Cat3-f и Cat4-r. Один из клонов Y. pestis EV НИИЭГ lpxM::cat был выбран для проведения дальнейшей работы.

Было проведено удаление кассеты устойчивости к хлорамфениколу в инактивированном гене с помощью вектора pCP20. Элиминацию плазмиды pCP20 из полученного штамма Y. pestis EV НИИЭГ lpxM проводили путем культивирования его в обогащенной среде при температуре +40 °C.

Отсутствие кассеты антибиотикоустойчивости в инактивированном гене ApRCmR клонов подтверждали методом ПЦР (рис. 3).

В результате было получено 4 чувствительных к ампициллину и хлорамфениколу клона мутантного штамма Y. pestis EVlpxM (ApSCmS) с инактивированным геном lpxM, синтезирующих модифицированный ЛПС, что обеспечивает образование молекул со сниженной токсичностью. Данное обстоятельство позволило нам предположить снижение реактогенности у полученных клонов и рассматривать их в качестве кандидатов в вакцинные.

Рисунок 3. Сравнительный анализ продуктов амплификации ДНК штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, EVlpxM::cat и EVlpxM.

Треки: 1,2 EVlpxM (1268 п.н.), 3,4 EVlpxM::cat (2198 п.н.), 5,6 EV НИИЭГ (2457 п.н.), 7  ДНК гидролизованная рестриктазой HindIII. Электрофорез в 0,7 % агарозном геле.

Для подтверждения корректности мутации по гену lpxM было проведено секвенирование участка хромосомы полученного штамма Y. pestis EVlpxM (рис. 4).

Рисунок 4. Сиквенс участка хромосомы штамма Y. pestis EVlpxM,

ограниченного праймерами Cat3-f и CatS-r.

Иммуногенность полученных клонов была предварительно оценена с помощью «феномена переживания» Н.Н. Гинсбурга. Суть феномена заключается в том, что клетки вирулентного штамма чумного микроба теряют способность вызывать летальную инфекцию у белых мышей и морских свинок при введении их в одном шприце с микробами вакцинного штамма Y. pestis. Величина LD50 вирулентного штамма Y. pestis является коррелятивным критерием иммуногенности вакцинного штамма.

В качестве вирулентного штамма был использован штамм Y. pestis 231, LD50 которого для мышей составляет 5 КОЕ, а Dcl - 25 КОЕ. Проведенные эксперименты позволили нам отобрать наиболее перспективный в качестве кандидата в вакцинные штаммы клон Y. pestis EVlpxМ, индекс иммунитета которого был в три раза выше, чем у исходного вакцинного штамма EV линии НИИЭГ. Этот клон использовали для подтверждения мутации с помощью структурного анализа ЛПС. Исследование масс-спектра ЛПС Y. pestis EVlpxМ показало отсутствие остатка лауриновой кислоты в липиде А мутантного штамма и подтвердило, что бактериальные клетки штамма Y. pestis EVlpxМ продуцируют ЛПС, содержащий только тетра – и пентаацильные варианты липида А. Следовательно, введенная нами мутация приводила к прекращению синтеза соответствующей ацилтрансферазы LpxM. Выбранный и предварительно охарактеризованный клон Y. pestis EV lpxМ использовали для сравнительной оценки эндотоксических и иммуногенных свойств и оценки его в качестве кандидата в вакцинные.

Изучение эндотоксических свойств ЛПС lpxM мутанта вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ. Была оценена эндотоксическая активность препаратов ЛПС, выделенных из вакцинного штамма Y. pestis EV и его LpxM мутанта - EVlpxМ.

Установлено, что все биологические эффекты ЛПС опосредуются цитокинами, наиболее значимым из которых является TNF- [Beutler, Cerami, 1988; Dinarello, 1991]. Именно с повышенной концентрацией этого цитокина связывают основные проявления системных повреждений при поствакцинальных реакциях и эндотоксическом шоке. Свойства нокаутных мутантов грамотрицательных микроорганизмов с инактивированным геном lpxM были предметом многочисленных исследований [Шайхутдинова, 2008; Vorachek-Warren, 2002, d’Hauteville et al., 2002; Low et al., 1999; Somerville et al., 1999]. Во всех случаях подобные мутанты синтезировали ЛПС со сниженной эндотоксической активностью.

Полученные данные подтвердили, что модифицированный ЛПС слабее индуцирует синтез TNF- макрофагами по сравнению с ЛПС «дикого типа». Использование клеток-мишеней различной видовой принадлежности позволило установить, что уменьшение эндотоксической активности мутантного ЛПС более выражено на человеческих, и менее - на мышиных клетках-мишенях (рис. 5).

Рисунок 5. Уровни TNF- в супернатанте макрофагоподобных мышиных клеток J774.1A (А) и моноцитарных клеток человека U937 (Б) после стимуляции препаратами ЛПС из штаммов Y. pestis EV НИИЭГ и EVlpxM

Таким образом, моноциты человека были значительно более чувствительны к структурной модификации ЛПС по сравнению с мышиными макрофагами.

Выявленное различие провоспалительного ответа макрофагов разной видовой принадлежности на действие исходного и мутантного ЛПС, скорее всего, обусловлено разной специфичностью рецепторов к ЛПС у человека и мыши [Delude et al., 1995; Golenbock et al., 1991]

Данные, полученные на мышиной клеточной модели in vitro, согласовались с данными, полученными на мышах линии Balb/C. Внутрибрюшинное введение обоих препаратов ЛПС мышам, сенсибилизированным актиномицином Д, приводило к индукции синтеза TNF-, уровни которого в сыворотке мышей после введения ЛПС исходного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ достоверно превышали аналогичный показатель для препарата ЛПС EVlpxM (рис. 6).

Рисунок 6. Концентрация TNF- в сыворотке крови актимицин Д-сенсибиллизированных мышей после внутрибрюшинного введения препаратов ЛПС, выделенных из штаммов Y. pestis EVlpxM и EV НИИЭГ

Определение LD50 для ЛПС родительского и мутантного штаммов Y. pestis EV показало, что делеция гена lpxM приводит к пятикратному снижению токсичности ЛПС, синтезируемого мутантными бактериальными клетками, для мышей (табл. 1).

Таблица 1. Токсичность препаратов ЛПС для несенсибилизированных и сенсибилизированных актиномицином Д Balb/C мышей

Источник ЛПС LD50 (пределы колебаний)
Несенсибилизированные мыши Сенсибилизированные актиномицином Д (10 мкг/мышь)
Y. pestis EV НИИЭГ 129,7 (32,6-516,2) 2,5 (0,6-9,8)
Y. pestis EVlpxM 648,3 (205-5149,3) 12,3 (3,1-49,1)

Таким образом, результаты экспериментов in vivo коррелировали с данными экспериментов на клеточных культурах, что позволяет говорить о валидности данных, полученных in vitro.

Изучение биологических свойств штамма Y. pestis EVlpxM в экспериментах на животных моделях. Оценка безвредности этого клона продемонстрировала снижение его токсических свойств для белых мышей линии Balb/C и беспородных мышей по сравнению с исходным штаммом EV НИИЭГ. Иммунизация мышей мутантным штаммом EVlpxM не вызывала гибели животных при подкожном введении его в дозах от 102 до 107 КОЕ, тогда как введение эталонного штамма EV НИИЭГ в дозах 105 и 107 КОЕ на мышь приводило к гибели 10-40 % животных (табл. 2). У всех павших мышей из органов (мозг, селезенка, легкие, печень, лимфоузлы) и крови выделялась чистая культура Y. pestis EV НИИЭГ, уровень обсемененности селезенки и крови достигал 108 КОЕ.

Таблица 2. Безвредность вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и его LpxM варианта для мышей.

Вакцина Иммунизирующая доза (КОЕ) Balb/C беспородные
Число погибших/общее Число погибших/общее
Y. pestis EV НИИЭГ 2  102 0/10 0/10
103 0/10 0/10
104 0/10 0/10
105 0/10 1/10*
107 4/10* 3/10*
Y. pestis EVlpxM 2  102 0/10 0/10
103 0/10 0/10
104 0/10 0/10
105 0/10 0/10
107 0/10 0/10

* выделена культура Y. pestis EV НИИЭГ

Определение показателей персистенции клеток вакцинного штамма Y. pestis в органах мышей позволяет оценить перспективы развития вакцинального процесса. Уровень обсемененности регионарных лимфоузлов мышей, иммунизированных мутантным штаммом Y. pestis EVlpxM, в первые сутки после вакцинации был достоверно выше, чем обсемененность лимфоузлов мышей, которым вводили бактериальные клетки родительского штамма (табл. 3). Вес регионарных лимфоузлов у мышей, иммунизированных мутантным штаммом, на вторые и третьи сутки после вакцинации был достоверно ниже, чем у мышей, иммунизированных исходным штаммом EV.

Таблица 3. Вес и обсемененность органов мышей после подкожного введения штаммами Y. pestis EV НИИЭГ и EV lpxM.

Штамм Y. pestis Дни после заражения Лимфоузлы Селезенки
Средний вес, мг Lg КОЕ/г органа Средний вес, мг Lg КОЕ/г органа
EV НИИЭГ 1 52,4 ± 15,9 3,6 ± 0,2* 150,5 ± 26,3 3,0 ±0,3
2 74,6 ± 13,3* 4,1 ±0,1 125,7 ± 15,9 3,4 ±1,0
3 72,3 ± 13,8* 3,8 ±0,5 106,4 ± 19,9 3,9 ±0,4
4 51,9 ± 11,3 3,3 ±0,2 130,7 ± 27,6 4,4 ±0,2
5 44,7 ±9,7 0 121,8 ± 12,1 0
6 42,9 ±8,1 0 118,4 ± 13,1 0
EV lpxM 1 38,3 ± 7,8 4,2 ± 0,3* 154,3 ± 75,3 2,7 ±0,5
2 40,8 ± 12,4* 4,1 ±0,2 134,0 ± 21,6 3,6 ±0,4
3 42,9 ± 10,4* 4,2 ±0,4 116,7 ± 22,2 3,7 ±1,0
4 46,6 ± 12,6 3,4 ±0,2 109,7 ± 7,4 4,4 ±0,3
5 40,7 ±5,8 0 98,2 ± 11,7 2,9 ±0,2
6 32,4 ±2,3 0 96,8 ± 9,4 0

* различия между группами статистически достоверны (p < 0,05)

Было показано, что уменьшение воспаления в лимфоузлах сопровождалось увеличением приживаемости и размножения в них бактериальных клеток мутантного штамма Y. pestis.

Одной из важнейших характеристик иммуногенности вакцинных штаммов является их антигенность. Для оценки антигенных свойств lpxM мутанта вакцинного штамма Y. pestis была изучена его способность индуцировать гуморальный иммунный ответ у мышей. Титры антител к двум основным протективным антигенам Y. pestis – F1 и V - были определены в сыворотках мышей Balb/C на 21 сутки после однократной иммунизации штаммами Y. pestis EV линии НИИЭГ и EVlpxM в дозе 107 КОЕ (табл. 4).

Таблица 4. Реципрокные титры к антигенам в сыворотках мышей, иммунизированных штаммами Y. pestis EV линии НИИЭГ и EVlpxM.

Штаммы Y. pestis Средний титр ± доверительный интервал (разброс значений титров в группе)
F1 V
EV линии НИИЭГ 1066,7 (800-1600) 133,3 (100-200)
EVlpxM 10666,7 (6400-12800) 1066,7 (800-1600)

При одинаковой дозе иммунизации штамм Y. pestis EVlpxM индуцировал у мышей существенно более высокий уровень гуморального иммунного ответа на иммунодоминантные антигены Y. pestis по сравнению с родительским штаммом EV НИИЭГ (табл. 4). Таким образом, мутантный штамм Y. pestis EVlpxM по своим антигенным свойствам оказался существенно превосходящим родительский штамм EV НИИЭГ.

Заключительным этапом исследований было изучение протективных и иммуногенных свойств получен ного штамма Y. pestis EVlpxM в сравнении с родительским штаммом.

Согласно МУ 3.3.1.1113-02 «Основные требования отбора новых вакцинных штаммов чумного микроба» [2002], испытуемый вакцинный штамм Y. pestis должен предохранять белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в той же или большей степени, что и эталонный штамм EV НИИЭГ, и индуцировать формирование у животных напряженного и длительного иммунитета.

Протективная способность штамма определяется его иммуногенностью, которая в свою очередь оценивалась по величине ED50 (рис. 7). Делеция гена lpxM приводила к снижению показателя ED50 для мутантного штамма Y. pestis EVlpxM в 2,5 раза, что свидетельствует о повышении его иммуногенности.

Рисунок 7. ED50 вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и EVlpxM для мышей линии Balb/C при последующем заражении клетками вирулентного штамма Y. pestis 231

в дозе 200 Dcl

Напряженность иммунитета определялась по способности исследуемого вакцинного штамма предохранять животное от гибели после заражения массивной дозой вирулентной культуры Y. pestis и оценивалась по LD50 для мышей, иммунизированных 104 КОЕ исследуемого вакцинного штамма Y. pestis, а также индексу иммунитета (табл. 5).

Напряженность иммунитета, создаваемого культурой испытуемого вакцинного штамма, превышала аналогичный показатель, полученный на животных, иммунизированных культурой вакцинного штамма EV в четыре раза.

Таким образом, исследования подтвердили, что делеция гена lpxM, приводит к снижению эндотоксической активности ЛПС и остаточной вирулентности бактериальных клеток Y. pestis EV. При этом иммуногенность и протективность мутантного штамма EVlpxM возрастает.

Таблица 5. Показатели напряженности иммунитета для мышей линии Balb/С, вакцинированных Y. pestis EV НИИЭГ и его LpxM вариантом.

Иммунизирующий штамм LD50 (КОЕ) Y. pestis 231 Индекс иммунитета
Y. pestis EVlpxM 108 5 107
Y. pestis EV НИИЭГ 2,5 107 1,25 107

Суммируя все полученные данные, можно заключить, что полученный нами штамм Y. pestis EVlpxM по своим культурально-морфологическим свойствам не отличались от исходного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ, обладал меньшей остаточной вирулентностью для мышей по сравнению с родительским штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Мутантный штамм был способен к более эффективному размножению в лимфоузлах по сравнению с родительским штаммом, но при этом вызывал менее выраженное воспаление. Считается, что более выраженная остаточная вирулентность вакцинного штамма обеспечивает формирование более эффективного противочумного иммунитета. Однако в наших исследованиях иммунизация мутантным штаммом Y. pestis EVlpxM приводила к индукции более высокого специфического антительного ответа на иммунодоминантные антигены Y. pestis F1 и V по сравнению с исходным штаммом Y. pestis EV НИИЭГ. Кроме того, штамм Y. pestis EVlpxM предохранял белых мышей от подкожного заражения вирулентной культурой чумного микроба в 2,5 раза более успешно по сравнению с эталонным штаммом EV НИИЭГ и индуцировал у животных формирование более напряженного иммунитета.

Продукция TNF- макрофагами человека и мыши после стимуляции их ЛПС из Y. pestis EVlpxM была значительно ниже по сравнению с продукцией TNF-, индуцированной ЛПС родительского штамма EV НИИЭГ. Снижение воспалительного ответа макрофагов на этапе внедрения инфекции позволяет бактериальным клеткам мутантного штамма EVlpxM успешнее преодолевать фагоцитарный барьер и диссеминировать в организме, что и приводит в конечном итоге к более высокому уровню протективного иммунитета.

Следует отметить, что различие в способности к стимуляции продукции TNF- между ЛПС эталонного вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ и ЛПС его LpxM– варианта было гораздо более выражено на человеческих моноцитах по сравнению с мышиными макрофагами. Поскольку данные по эндотоксической активности мутантного ЛПС полученные в экспериментах in vitro на клеточных культура, коррелировали с данными экспериментов in vivo, нельзя не согласиться с мнением С.В. Дентовской с соавт. [2006] – "принимая во внимание то, что одни и те же структурные варианты липида А могут вызывать эндотоксические эффекты разнонаправленного действия у человека и мыши или отличаться по степени токсичности для этих видов на несколько порядков, можно прогнозировать, что наиболее выраженный эффект снижения реактогенности будет проявляться при клиническом применении подобных вакцин, а не при их испытаниях на лабораторных животных".

Перспективным направлением дальнейших исследований может быть получение lpxM мутантов на основе других высокоиммуногенных штаммов Y. pestis, аттенуированных за счет делеции существенных для вирулентности генов, несвязанных с pgm локусом, отсутствующим у вакцинного штамма EV. разработанный способ мутагенеза гена lpxM делает возможным получение подобных мутантов Y. pestis на основе любых родительских штаммов чумного микроба.

Выводы

1. Разработан способ для контролируемого конструирования лишенных маркеров лекарственной устойчивости lpxM мутантов Y. pestis – кандидатов в вакцинные штаммы со сниженной реактогенностью. Методическая схема включает в себя: прямой сайт-направленный мутагенез по методике K.A. Datsenko и B.L. Wanner [2000] в клетках Y. pestis, переклонирование мутантной аллели lpxM::cat в суицидный вектор pCVD442 в клетках E. coli, гомологичную рекомбинацию in vivo и удаление кассеты устойчивости к антибиотику в клетках Y. pestis. Разработанные методические подходы могут быть легко адаптированы для других грамотрицательных бактерий.

2. Подтверждена корректность проведения сайт-направленного мутагенеза с помощью секвенирования сконструированной аллели гена lpxM, определения структуры ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVlpxM, а также изучения основных фенотипических характеристик сконструированного штамма.

3. Впервые доказано, что «феномен переживания» Н.Н. Гинсбурга [1969] пригоден для оценки иммуногенности вакцинных штаммов чумного микроба не только с высокой, но и со сниженной "остаточной вирулентностью".

4. Подтверждено, что созданный на основе вакцинного штамма Y. pestis EV линии НИИЭГ нокаутный мутант по гену lpxM, лишенный маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирует ЛПС со сниженной способностью стимулировать продукцию TNF-.

5. Показано, что степень снижения провоспалительной активности ЛПС, синтезируемого мутантным штаммом Y. pestis EVlpxM значительно выше в тестах на клетках-мишенях человека по сравнению с мышиной моделью.

6. Впервые показано, что снижение “остаточной вирулентности” штамма Y. pestis EVlpxM не приводит к уменьшению эффективности вакцинации, но, напротив, сопровождается повышением его иммуногенности.

Список, опубликованных работ по теме диссертации.

1. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner B., Kondakova A.N., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Holst O., Pier G.B., Knirel Y.A., Motin V.L. Yersinia pestis live vaccine with improved characteristics // Procedia in Vaccinology. – 2009. – V 1 (1). – P 97–100.

2. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner B., Kondakova A.N., Bystrova O.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Holst O., Pier G.B., Knirel Y.A., Anisimov A.P., Motin V.L. Pleiotropic effects of the lpxM mutation in Yersinia pestis resulting in modification of the biosynthesis of major immunoreactive antigens // Vaccine. – 2009. - V 27. – P. 2240-2250

3. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner B., Kondakova A.N., Bystrova O.V., Kocharova N.A., Senchenkova S.N., Holst O., Pier G.B., Knirel Y.A.,, Motin V.L. Development of new generation of plague vaccines with improved safety and immunity // Abstracts of the 1st annual Biosafety Association for Central Asia and Caucasus conference "Biosafety and Bacterial-Viral Zoonotic Diseases" (May 18-20, 2009, Almaty, Kazakhstan). Almaty: BACAC, 2009. P. 85.

4. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner B., Kondakova A.N., Pier G.B., Knirel Y.A., Motin V.L. A live plague vaccine candidate with improved safety and immunogenisity // Abstracts of the 46th Oholo Conference: "The Challenge of Highly Pathogenic Microorganisms – Mechanism of Virulence and Novel Medical Countermeasures" (October 25-29, 2009, Eilat, Israel). Ness-Ziona: Institute for Biological Research, 2009, p. 35

5. Панькина Л.Н., Федорова В.А., Савостина Е.П., Саяпина Л.В., Дентовская С.В., Шайхутдинова Р.З., Агеев С.А., Линднер Б., Кондакова А.Н., Кочарова Н.А., Сенченкова С.Н., Книрель Ю.А., Мотин В.Л. Модификация синтеза липополисахарида (ЛПС) и иммунодоминантных антигенов lpxM мутанта Yersinia pestis EV НИИЭГ, индуцирующего повышенный уровень иммунитета к чуме у мышей и морских свинок // Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008 г.). - Санкт-Петербург, 2008. – С. 98.

6. Агеев С.А., Шайхутдинова Р.З., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Конструиро вание варианта вакцинного штамма Yersinia pestis со сниженной ре актогенностью // Материалы шестой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 10-11 ноября 2009 г.), Москва, 2009, стр. 29.

7. Агеев С.А., Шайхутдинова Р.З., Бахтеева И.В., Титарева Г.М., Комбарова Т.И., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Изучение иммуногенности LpxM–отрицательных вариантов вакцинного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ с помощью «феномена переживания» при экспериментальной чуме // Материалы научно практической школы конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.) Оболенск, 2010, стр. 255-257.

8. Feodorova V.A., Pan’kina L.N., Savostina E.P., Kuznetsov O.S., Konnov N.P., Sayapina L.V., Dentovskaya S.V., Shaikhutdinova R.Z., Ageev S.A., Lindner B., Kondakova A.N., Holst O., Pier G.B., Knirel Y.A., Anisimov A.P., Motin V.L. A live plaque vaccine candidate with improved safety and immunogenicity // The challenge of highly pathogenic microorganisms: Mechanisms of virulence and novel medical countermeasures. Shafferman A., Velan B., Ordentlich A. (Eds.) 1st Edition, 2010, XVIII, 261-268. DOI: 10.1007/978-90-481-9054-6_28

Список сокращений и условных обозначений

ГНЦ ПМБ - Государственный научные центр прикладной микробиологии и биотехнологии

ИИ – индекс иммунитета

ИФА – иммуно-ферментный анализ

КОЕ – колониеобразующая единица

ЛПС - липополисахарид

МЖК - музей живых культур

м.к. – микробная клетка

мкг - микрограмм

МС – масс-спектрометрия

нг - нанограмм

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ЯРМ - ядерный магнитный резонанс

ApS(R) – чувствительность (устойчивость) к ампициллину

CmS(R) - чувствительность (устойчивость) к хлорамфениколу

cat - ген, кодирующий хлорамфениколацетилтрансферазу

Dcl - абсолютно летальная доза (dosis certa letalis)

ED50 – наименьшее количество микробов, способных индуцировать формирование специфического иммунитета, обеспечивающего выживание 50 % животных, вакцинированных этой дозой и зараженных на 21-е сутки 200 Dcl вирулентного штамма Y. pestis

F1 - капсульный антиген - "фракция I" (fraction I)

FRT - Flp –recombinase target site –сайты распознования Flp-рекомбиназы

LB - среда Luria-Bertani

LD50 - доза летальная для 50 % животных (dosis letalis 50)

lpxM - ген, отвечающий за включение КДО-зависимой ацилтрансферазой остатков лауриновой кислоты к глюкозаминовым единицам посредством образования сложноэфирных связей с гидроксильными группами остатков -гидроксимиристиновых кислот в E. coli

LpxM - миристоилтрасфераза Escherichia coli (у Y. pestis и Yersinia pseudotuberculosis – лаурилтрасфераза

SucS(R) - чувствительность (устойчивость) к сахарозе

TNF- - фактор некроза опухолей-альфа (tumor necrosis factor-)

V – антиген Y. pestis

Благодарности

Приношу свою искреннюю благодарность моим научным руководителям д.м.н., профессору А.П. Анисимову и к.м.н Дентовской С.В. за неизменно высокий интерес и огромную помощь в формировании научной концепции работы.

Приношу благодарность всем членам ученого совета, а также моим научным рецензентам Е. А. Панферцеву и Н. К. Фурсовой за глубокую проработку моей диссертационной работы и ценные замечания, которые будут учтены при проведении дальнейших исследований.

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю благодарность Бахтеевой И.В., Шайхутдиновой Р.З., Комбаровой Т.И., Титаревой Г.М., Кравченко Т.Б., а также всем моим соавторам и сотрудникам ГНЦ ПМБ, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации.

Приношу искреннюю признательность неофициальным рецензентам настоящей работы за замечания, вопросы и поправки, которые были учтены при ее написании.



 


Похожие работы:

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»







Загрузка...



 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.