WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов mycobacterium tuberculosis

Федеральное государственное учреждение науки

государственный научный центр прикладной

микробиологии и биотехнологии

на правах рукописи

Богун Александр Геннадьевич

Использование молекулярно-генетических методов

для комплексного анализа штаммов

Mycobacterium tuberculosis

03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оболенск 2010 г.

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Черноусова Лариса Николаевна

Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Защита состоится 10 декабря 2010 г. в 12 00 на заседании Диссертационного совета в Федеральном государственном учреждении науки «Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации.

по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ПМБ.

Автореферат разослан 08 ноября 2010 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Фурсова Н.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Туберкулёз является главным фактором инвалидизации и смертности, имеющим бактериальную природу [Кононец A.C. и др., 2010; Золотарёва Л.В. и др., 2010]. Эпидемия ВИЧ инфекции привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [Корнилова З.Х. и др., 2010], а распространение штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, создало дополнительные сложности при лечении туберкулёза [Крапина Н.Л. и др., 2010; Drobniewski F. et al., 2005].

Существует множество работ, иллюстрирующих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [Кисличкина A.A., 2009; Lazzarini L. et al., 2008]. Показано, что популяция микобактерий является клональной [Земскова З.С. и др., 2010; Sreevatsan S. et al., 1997]. Для анализа микобактерий используется несколько методов генотипирования, но получаемые результаты часто противоречат друг другу [Supply P. et al., 2006; Gagneux S. et al., 2007; Kremer K. et al., 2005].

Наиболее полная информация о структуре популяции возбудителя туберкулёза, получена, вероятно, в результате анализа 89 генов [Comas Т. et al., 2009]. Необходимость изучения большого количества генов для филогенетического анализа штаммов M. tuberculosis методом мультилокусного секвенирования связана с низким полиморфизмом генома. Это обстоятельство значительно усложняет анализ штаммов и ограничивает применение мультилокусного секвенирования для генотипирования M. tuberculosis.

Другим подходом является анализ полиморфных нуклеотидов, обнаруженных в разных участках хромосомы штаммов M. tuberculosis с полностью идентифицированными геномами [Filliol I. et al., 2006; Gutacker M. et al., 2006]. В результате сравнения последовательностей нуклеотидов в геномах штаммов M. tuberculosis – H37Rv, 1551, 210 и штамме M. bovis AF2122/97 и последующего анализа бактериальных культур, выделенных от пациентов, разработана классификация, позволяющая определить принадлежность штамма к одной из семи групп SCG. Определение точечных мутаций в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПЦР. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет эффективно дифференцировать клинические изоляты микобактерий.

Традиционные методы генетического анализа M. tuberculosis также по ряду причин не являются совершенными. При использовании метода RFLP-IS6110 данные, полученные в разных лабораториях, трудно сравнивать между собой. Сполиготипирование основано на анализе только одного участка хромосомы, который к тому же подвержен конвергентной эволюции, а для метода MIRU-VNTR окончательно не определён набор анализируемых локусов.

Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое выявление штаммов M. tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также обнаружение источников и путей распространения таких штаммов. Наибольшим потенциалом для этих целей обладают молекулярно-генетические методы, основанные на ПЦР, так как они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества бактериальной культуры.

Эффективный мониторинг штаммов M. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без наличия единой системы идентификации. Так как в настоящее время все используемые методы генотипирования штаммов M. tuberculosis имеют недостатки, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.

Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует единый алгоритм генетической идентификации штаммов M. tuberculosis. Такой алгоритм должен базироваться на методах, требующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, должен позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.





Цель данной работы – комплексное исследование клинических изолятов M. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.

Задачи исследования.

  1. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом сполиготипирования.
  2. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом RFLP-IS6110.
  3. Изучение клинических изолятов M. tuberculosis методом MIRU-VNTR.
  4. Определение принадлежности клинических изолятов M. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.
  5. Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов M. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.
  6. Анализ информативности разных методов генотипирования M. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.

Научная новизна работы. Впервые проведён анализ клинических изолятов M. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования – RFLP-IS6110, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.

Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипических особенностях клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипирования штаммов M. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения конкретных штаммов среди пациентов лечебных учреждений, в том числе штаммов, обладающих лекарственной устойчивостью. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности штамма к индивидуальным филогенетическим группам, что позволяет отслеживать интродукцию штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.

Положения, выносимые на защиту.

1) Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 локусов в геноме туберкулезного микроба.

2) Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов M. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность клинических изолятов к отдельным филогенетическим линиям.

3) Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе проанализированы все клинические изоляты M. tuberculosis (n 330), выделенные от больных с диагнозом туберкулёз лёгких, обратившихся в медицинские учреждения г. Тулы в период с июня 2001 по июнь 2002 г. Для культивирования изолятов M. tuberculosis использовали питательную среду Левенштейна-Йенсена. Выделение ДНК из культуры M. tuberculosis осуществляли методом СТАВ.

На основании анализа литературы для проведения исследования нами выбраны 35 MIRU-VNTR локусов. При их выборе учитывали следующие критерии: 1) наличие локуса в каком-либо широко используемом наборе локусов для MIRU-VNTR типирования; 2) наличие литературных данных о том, что в каком-либо исследовании для данного локуса был обнаружен высокий уровень полиморфизма; 3) длина тандемного повтора должна превышать 40 п.о., что необходимо для анализа ампликона с помощью электрофореза в агарозном геле. ПЦР проводили на амплификаторе Dyad фирмы Bio-Rad. Размер ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза в 2 %-ном агарозном геле при окрашивании бромистым этидием. Для оценки полиморфизма использовали коэффициент Hunter-Gaston (h) [Hunter P., 1988]. Построение филогенетической схемы для клинических изолятов M. tuberculosis по данным MIRU-VNTR осуществляли с помощью программы Population 1.2.30.

Принадлежность клинических изолятов к геногруппам, идентифицированным на основании SNP-типирования, осуществляли в соответствии с классификацией, предложенной Filliol [Filliol I. et al., 2006]. Для SNP-анализа использовали мультиплексную аллель-специфичную ПЦР [Игнатова A.H., 2007]. Сполиготипирование проводили по стандартной методике [Kamerbeek J. et al., 1997]. Анализ RFLP-IS6110 выполняли в соответствии с van Embden [van Embden J. et al., 1993].

При определении лекарственной устойчивости изолятов M. tuberculosis к стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину использовали метод абсолютных концентраций, в соответствии с приказами минздрава [Приказ № 558, от 8 июня 1978 г.; Приказ № 109, от 21 марта 2003 г.]. Для определения молекулярных механизмов устойчивости к лекарственным препаратам секвенировали гены 16SrRNA, embB, katG, pncA, rpoB, и rpsL. Последовательности фрагментов генов определяли на анализаторе MegaBACE 750 ("Amersham Bioscience", США) согласно инструкциям производителя.

Результаты исследований и их обсуждение

Подбор условий проведения анализа MIRU-VNTR

В работе использовали референсный штамм M. tuberculosis H37Rv и 54 клинических изолята M. tuberculosis, принадлежащих к наиболее распростра-

а

б

в

Рисунок 1 - ПЦР-анализ ДНК штамма M. tuberculosis H37Rv по 29 MIRU-VNTR локусам и делеции TbD1:а) Реакционная смесь без дополнительных компонентов (маркер ДНК “50 bp DNA Ladder), б) ПЦР в присутствии 5 % ДМСО (маркер ДНК “O’RangeRuler 50 bp DNA Ladder), в) ПЦР в присутствии 1,5 М бетаина (маркер ДНК “O’RangeRuler 50 bp DNA Ladder”). 1 – маркер ДНК, 2 – ETR A, 3 – ETR B, 4 – ETR C, 5 – MIRU 2, 6 – MIRU 4, 7 – маркер ДНК, 8 – MIRU 10, 9 – MIRU 16, 10 – MIRU 20, 11 – MIRU 23, 12 – MIRU 24, 13 – маркер ДНК, 14 – MIRU 26, 15 – MIRU 27, 16 – MIRU 31, 17 – MIRU 39, 18 – MIRU 40, 19 – маркер ДНК, 20 – TbD1, 21 – QUB-11a, 22 – QUB-11b, 23 – QUB-26, 24 – VNTR 0424, 25 – маркер ДНК, 26 – VNTR 1895, 27 – VNTR 1955, 28 – VNTR 1982, 29 – VNTR 2347, 30 – VNTR 2401, 31 – маркер ДНК, 32 – VNTR 3171, 33 – VNTR 3232, 34 – VNTR 3336, 35 – VNTR 3690, 36 – VNTR 4156, 37 – маркер ДНК.

ненным в РФ геногруппам. Анализ данных RFLP-IS6110 и сполиготипирования позволил сделать заключение о том, что охарактеризованные клинические изоляты не являются смесью нескольких культур M. tuberculosis.

В результате были подобраны условия проведения ПЦР, позволяющие амплифицировать участки ДНК, содержащие тандемные повторы без использования дорогостоящих наборов и полимеразы с горячим стартом. Показано, что наиболее благоприятные условия для ПЦР возникают при добавлении в реакционную смесь ДМСО в концентрации 5% или бетаина в концентрации 1,5М (рис. 1).

Анализ клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR

MIRU-VNTR-анализ клинических изолятов M. tuberculosis (n 330) проводили по 35 локусам. Условия реакции, подобранные для анализа 29 MIRU-VNTR локусов (рис. 1), также позволяют проводить анализ дополнительных шести локусов. Введение в реакционную смесь ДМСО позволило получить данные для всех 330 изолятов по 35 MIRU-VNTR локусам, выбранным для анализа, без использования процедуры горячего старта. Кроме того, использование ДМСО позволило проводить реакцию амплификации при единой для всех локусов концентрации MgCl2 равной 1,5 мМ MgCl2.

При анализе результатов MIRU-VNTR выявлено, что большая часть изученных клинических изолятов M. tuberculosis (n 291; 89 %) являются чистыми культурами; 28 изолятов (8 %) являются смесью нескольких штаммов, поскольку содержат большое количество двойных аллелей; а 11 изолятов (3 %) имеют два аллеля только для одного из локусов. В дальнейшем при сопоставлении информативности разных методов генотипирования мы использовали данные, полученные только для тех изолятов, которые не имеют двойных аллелей (n 291). Количество повторов варьировало от 0 для локусов ETR-F и VNTR 0569 до 28 для локуса VNTR 1895. Всего, при анализе 35 локусов обнаружено 185 профилей MIRU-VNTR: 158 изолятов имеют уникальные MIRU-VNTR профили, а 133 изолята входят в состав 27 кластеров. Индекс разнообразия генотипов MIRU-VNTR (h) равен 0,96.

Пятнадцать кластеров состояли из двух изолятов, шесть кластеров – из трёх изолятов, два кластера – из четырёх изолятов, один – из пяти изолятов, один – из семи изолятов, один – из десяти изолятов и один – из 55 изолятов. Определены индексы полиморфизма (h) для каждого локуса MIRU-VNTR, которые имеют значения от 0 до 0,8 для разных локусов (табл. 1). Таким образом, среди изученных нами локусов оказались локусы как с высоким, так и с низким полиморфизмом.

Таблица 1 - Индексы полиморфизма локусов MIRU-VNTR

Локус h Локус h Локус
h Локус h Локус h
MIRU 02 0,49 MIRU 26 0,53 QUB 26 0,73 VNTR 0595 0,01 VNTR 3171 0,06
MIRU 04 0,11 MIRU 27 0,03 ETR A 0,63 VNTR 1443 0,52 VNTR 3232 0,80
MIRU 10 0,64 MIRU 31 0,66 ETR B 0,05 VNTR 1895 0,31 VNTR 3336 0,71
MIRU 16 0,29 MIRU 39 0,48 ETR C 0,69 VNTR 1955 0,60 VNTR 3690 0,58
MIRU 20 0,06 MIRU 40 0,69 ETR-F 0,56 VNTR 1982 0,72 VNTR 3820 0,70
MIRU 23 0,19 QUB-11a 0,71 VNTR 0424 0,59 VNTR 2347 0,07 VNTR 4120 0,68
MIRU 24 0 QUB-11b 0,66 VNTR 0569 0,12 VNTR 2401 0,60 VNTR 4156 0,28




Анализ сполигопаттернов клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

Изучение сполигопаттернов проведено только для тех клинических изолятов M. tuberculosis, которые, согласно данным MIRU-VNTR, являются гомогенными культурами (n 291). При их анализе обнаружено 52 сполиготипа, 33 из которых идентичны опубликованным в международной базе данных spol4. Для изолятов, сполиготипы которых не представлены в базе данных spol4, принадлежность к сполигосемействам определена на основании рекомендаций, изложенных в работе Sebban M. [Sebban M. et al., 2002]. Показано, что исследованные изоляты M. tuberculosis принадлежат к девяти сполигосемействам: Beijing (n 98), Beijing-LIKE (n 1), Haarlem (n 27), LAM (n 106), LAM3 and S/convergent (n 1), S (n 2), T (n 51), U (n 3), и X (n 1) (рис. 3). Рассчитанный индекс полиморфизма сполиготипов (h) равен 0,85.

Наиболее объёмный кластер состоит из 82 изолятов, имеющих сполиготип (000000000003771), относящийся к сполигосемейству Beijing (табл. 2). Вторым по величине оказался кластер, состоящий из 73 изолятов, принадлежащих к сполигосемейству LAM9. Согласно литературным данным, сполиготипирование обладает низкой разрешающей способностью для штаммов, входящих в сполигосемейство Beijing. Однако для штаммов, принадлежащих к сполигосемейству LAM, разрешающая способность данного метода оказывается более высокой. Таким образом, наличие большой группы клинических изолятов, имеющих сполиготип 777477607760771, оказывается характерным для клинической выборки, используемой в исследовании. Это подтверждается и тем, что в международную базу данных spol4 включены 3758 штамма, имеющих сполиготип 000000000003771, и только 39 штаммов, имеющих сполиготип 777477607760771.

Таблица 2 – Сполиготипы клинических изолятов M. tuberculosis

Сполиготип Сполигосемейство Количество изолятов в исследованной коллекции Количество штаммов в базе данных Spol4
000000000000000 U 1 0
000000000000771 Beijing-LIKE 1 38
000000000003171 Beijing 7 6
000000000003371 Beijing 3 26
000000000003731 Beijing 6 48
000000000003771 Beijing 82 3758
000000004020771 Haarlem2 1 283
000000007760771 LAM3-and-S/convergent 1 118
003777607760771 LAM9 1 3
377737777760771 T3 2 2
407777607760771 LAM9 1 3
674777377420771 Haarlem4 1 2
676377737760771 S 2 7
747777770060771 T 1 0
760377777420771 Haarlem 2 0
770000000760771 LAM1 1 0
770000737760751 X 1 0
770000777760771 T1_RUS2 3 46
774000000760771 T1 3 11
774777177420771 Haarlem 3 0
774777717760571 T 1 0
774777777420771 Haarlem4 7 88
775740003760771 T1 7 14
777002000000371 LAM 1 0
777457607760771 LAM 1 0
777477607760171 LAM1 1 0
777477607760771 LAM9 73 39
777600000060771 LAM 4 0
777677777420771 Haarlem 1 0
777701003760771 LAM 5 0
777737777420771 Haarlem4 1 74
777737777760731 T2-T3 1 114
777737777760771 T3 1 155
777740007760771 T1 1 24
777757777760771 T1 1 16
777760007760771 T5_RUS1 3 92
777761003760771 T1 1 0
777761007760771 T1 2 11
777763007760771 LAM 1 0
777775077760771 T 1 0
777777207760771 LAM9 1 6
777777377560771 T 1 0
777777377760771 T4 5 87
777777600000000 U 2 14
777777607760731 LAM4 1 83
777777607760771 LAM9 15 1227
777777737760571 T 2 0
777777774020771 Haarlem 6 721
777777777060771 T 4 0
777777777420771 Haarlem4 4 24
777777777720771 Haarlem3 1 1504
777777777760771 T1 12 2497
Всего 291

Анализ результатов SNP-типирования клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

На основании анализа точечных мутаций определена принадлежность 291 клинического изолята M. tuberculosis к индивидуальным филогенетическим группам. Показано, что в данной выборке присутствуют изоляты, принадлежащие ко второй (n 98; 33,7 %), третьей (n 41; 14,1 %), пятой (n 127; 43,6%) и шестой (n 25; 8,6 %) группам SCG.

Анализ клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ методом, RFLP-IS6110

Методом RFLP-IS6110 проанализирован 291 клинический изолят M. tuberculosis. При анализе результатов с помощью программы GelComparII 3.5 обнаружено 182 профиля RFLP-IS6110. Количество копий инсерционного элемента IS6110 в изученных изолятах варьирует от 4 до 21 (рис. 2). Индекс разнообразия профилей RFLP (h) равен 0,99. Сто тридцать пять изолятов M. tuberculosis имеют уникальные профили RFLP-IS6110. Пятьдесят шесть изолятов сформировали 28 кластеров, состоящих из

Рисунок 2 – Распределение изолятов M. tuberculosis по группам в зависимости от количества гибридизационных полос в профиле RFLP-IS6110

двух изолятов, 30 изолятов входят в 10 кластеров, состоящих из трёх изолятов, 20 изолятов сформировали пять кластеров, каждый из которых состоял из четырёх изолятов, а 16 изолятов сформировали два кластера, каждый из которых состоял из восьми изолятов. Также обнаружен один кластер, состоящий из семи изолятов и один кластер, состоящий из 17 изолятов M. tuberculosis.

Сопоставление информативности типирования клинических изолятов M. tuberculosis методами MIRU-VNTR и SNP

После получения результатов молекулярного типирования клинических изолятов M. tuberculosis четырьмя методами проведён анализ взаимосвязи между ними. По данным для 35 локусов MIRU-VNTR в программе Populations 1.2.30 с помощью метода «связывания ближайших соседей» (Neighbor Joint), построена дендрограмма генетического родства клинических изолятов M. tuberculosis. На ней изоляты сформировали пять групп – MIRU-VNTR-1, MIRU-VNTR-2, MIRU-VNTR-3a, MIRU-VNTR-3b, и MIRU-VNTR-4 (рис. 6). Все клинические изоляты, входящие в каждую группу MIRU-VNTR, являются членами только одной группы SCG.

Сопоставление информативности типирования клинических изолятов M. tuberculosis методами SNP и сполиготипирования

Генотипирование штаммов M. tuberculosis методом, основанным на анализе шести точечных мутаций, обладает низкой разрешающей способностью и не позволяет проводить тонкую генетическую дифференциацию штаммов. Поэтому при сопоставлении информативности этих двух методов использовали данные о принадлежности изолятов M. tuberculosis к сполигосемействам, а не данные, характеризующие структуру сполигопаттернов. Это позволило нам сопоставить насколько хорошо соотносится информация о принадлежности клинического изолята к большим филогенетическим группам, полученная при использовании данных методов.

Выяснилось, что 100% (n 98) изолятов, принадлежащих к SCG-2, относятся к сполигосемейству Beijing (рис. 3). Остальные SCG состоят из изолятов, принадлежащих к нескольким сполигосемействам. Среди изолятов, входящих в SCG-3, 2,4% (n 1) принадлежат к сполигосемейству Beijing-like, 65,9% (n 27) – к сполигосемейству Haarlem, а 31,7% (n 13) – к сполигосемейству T. Изоляты, входящие в SCG-5, принадлежат к пяти сполигосемействам. Из них к сполигосемейству LAM относится 83,4% изолятов (n 107), к сполигосемействам LAM3-S-conv, S, T, и U относятся 0,8% (n 1), 1,6% (n 2), 11,8% (n 15) и 1,6% (n 2) изолятов, соответственно. Среди изолятов, входящих в SCG-6, 92,0% принадлежит к сполигосемейству Т (n 23), а к сполигосемействам U и X принадлежит по одному изоляту (4%).

Из трёх изолятов, относящихся к сполигосемейству U, два (67%) принадлежит к SCG-5, а один (33%) – к SCG-6. Из 51 изолята, принадлежащих к сполигосемейству Т, к SCG-3 принадлежит 25% (n 13), к SCG-5 – 31% (n 16), а к SCG-6 – 43% (n 22). Таким образом, среди изолятов, принадлежащих к сполигосемейству Beijing (n 98), Beijing-like (n 1), Haarlem (n 27), LAM (n 107), LAM3-S-conv (n 1), S (n 2) и X (n 1), 100% изолятов входит в состав только одной SCG. Однако было обнаружено, что изоляты, принадлежащие к сполигосемействам U и Т, могут относиться к разным SCG группам.

Рисунок 3 – Распределение штаммов M. tuberculosis, принадлежащих к разным сполигосемействам среди обнаруженных SCG.

Индекс аллельного разнообразия при анализе 35 локусов MIRU-VNTR равен 0,97 для группы SCG2, 0,96 – для группы snp3, 0,8 – для группы SCG 5 и 0,96 – для группы SCG6. Согласно литературным данным, метод MIRU-VNTR, как правило, обладает меньшей разрешающей способностью в отношении штаммов сполигосемейства Beijing (группа SCG2). Однако, согласно нашим данным, минимальная разрешающая способность зарегистрирована для группы SCG5, состоящей преимущественно из изолятов сполигосемейства LAM.

Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость клинических изолятов M. tuberculosis к лекарственным препаратам у филогенетически связанных изолятов

При анализе группы MIRU-VNTR-3a показано, что в неё входят 55 изолятов, имеющих одинаковые профили MIRU-VNTR. При изучении клинических изолятов M. tuberculosis, филогенетически связанных с данной группой, выявлена клональная группа, состоящая из 92 изолятов, обладающих повышенной устойчивостью к лекарственным препаратам (рис. 6, табл. 3).

Таблица 3 – Лекарственная устойчивость изолятов M. tuberculosis группы MIRU-VNTR-3a

Лекарственный препарат Концентрация мг/л Количество ЛУ изолятов M. tuberculosis
Клональная группа Изоляты вне клональной группы
Стрептомицин 5 4 (4,3%) 9 (25,7%)
10 16 (17,4%) 10 (28,6%)
50 68 (73,9%) 5 (14,3%)
Изониазид 1 26 (28,3%) 13 (37,1%)
5 22 (23,9%) 0 (%)
25 38 (41,3%) 0 (%)
Этамбутол 2 42 (45,7%) 4 (11,4%)
5 2 (2,2%) 0 (%)
25 0 (0%) 0 (%)
Рифампицин 20 4 (4,3%) 5 (14,3%)
50 81 (88%) 8 (22,9%)
Канамицин 30 34 (37%) 7 (20%)
50 46 (50%) 0 (0%)

Данные о том, что эти клинические изоляты являются филогенетически связанной группой, были подтверждены в результате анализа мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам (табл. 4). Мутация 513 AC гена 16SrRNA, детерминирующая устойчивость к стрептомицину, обнаружена у 80 изолятов, входящих в клональную группу. Для изолятов, не входящих в клональную группу, характерна мутация в 43 кодоне гена rpsL. Изоляты, входящие в группу MIRU-VNTR-3a (SCG 5), но не относящиеся к клональной группе, не содержат мутации 516 GTC в гене rpoB. Даная мутация обнаружена только у двух изолятов, принадлежащих к группе MIRU-VNTR-2. Мутация 531 TTG обнаружена у трёх изолятов, принадлежащих к группе MIRU-VNTR-3a, но не относящихся к кластеру, хотя в группе MIRU-VNTR-1 (Beijing) она встречается наиболее часто. Сходня ситуация наблюдается с мутацией 526 GAC, приводящей к замене HisAsp, которая обнаруживается только у изолятов, входящих в клональную группу, тогда как для изолятов семейства Beijing характерна мутация TAC в этом же кодоне, но приводящая к замене HisTyr. По данным литературы [Hatfull G., 2000] мутации в 526 и 531 кодонах гена rpoB приводят к устойчивости к рифампицину примерно у 80% штаммов M. tuberculosis во всём мире. Однако среди изученных нами клинических изолятов наиболее распространённой оказалась мутация в 516 кодоне. Несмотря на то, что данная мутация приводит к формированию лекарственной устойчивости к рифампицину, она не вызывает устойчивости к другим рифамицинам, в частности к рифабутину.

Таблица 4 – Мутации, детерминирующие устойчивость к лекарственным препаратам клинических изолятов M. tuberculosis, принадлежащих к разным группам MIRU-VNTR

Лекарственный препарат Ген Мутация Группа MIRU-VNTR
1 2 3a 3b 4
Стрептомицин rpsL 43 AGG 33 3 2
88 AGG 2
88 ATG
16SrRNA 513 A-C 1 1 80
514 G-T
516 C-T 8 1
513 A-C+515 C-T 1
513 A-C+904 A-C 1
513 C-T+516 C-A 1
Рифампицин rpoB 510 CAT+516 TAC 1
511 CCG 2
516 TAC 6 2
516 GTC 2 73
522 CAG 2
525ACG526TCC527CAG 1
526 TAC 5
526 GAC 7
531 TGG 1
531 TTG 28 3 1
533 CCG 1
516 TAC+531 TTG 2
531 TTG+533 CCG 1

Молекулярно-генетические характеристики клинических изолятов M. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

В последнее время появляется всё больше данных о том, что филогенетические линии M. tuberculosis различаются как по вирулентности [Caws M. et al., 2008; de Jong B. et al., 2008; Thwaites G. et al., 2008], так и по устойчивости к лекарственным препаратам [Cox H. et al., 2005; Chakravorty S. et al., 2008]. Несмотря на это, единой системы классификации микобактериальных штаммов, учитывающей все свойства возбудителя тубёркулёза, пока не существует. Вероятно, наиболее современная информация о филогении микобактерий получена при изучении 89 генов (рис. 4). Мы дополнили данную дендрограмму, определив на основании принадлежности штаммов к сполигосемействам принадлежность их к филогенетическим линиям, идентифицированным на основании анализа точечных мутаций [Filliol I. et al., 2006; Vultos T. et al., 2008; Comas I. et al., 2009].

Как видно из рисунка 4, для сполигосемейств Cameroon, Uganda, AFRi-1 и AFRi-2, в настоящее время не существует классификации в соответствии с принадлежностью к SCG. Тем не менее, все остальные основные филогенетические линии, определенные на основании принадлежности к SCG, выявляются также и при изучении 89 генов M. tuberculosis. Однако филогенетические группы SCG3, SCG4, SCG5, SCG6 являются подгруппами Европейско-Американской линии (Lineage 4), в то время как подгруппа SCG-3a является самостоятельной филогенетической линией (Lineage 4).

В нашем исследовании не обнаружены изоляты, принадлежащие к SCG-1, SCG-4 и SCG-7. Штаммы SCG-1 являются членами сполигосемейства EAI, распространенного в Восточной Африке и Индии, и встречаются в Российской Федерации редко [Comas I. et al., 2009; Reed M. et al., 2009]. Возможно, по этой причине они отсутствуют в нашей коллекции. Штаммы, принадлежащие к SCG-7, относятся к M. bovis. Всего один изученный изолят принадлежит к сполигосемейсву Х, однако, его сполиготип отсутствует в международной базе данных Spol4, и принадлежность его к сполигосемейству X определена на основании эвристических алгоритмов [Sebban M. et al., 2002]. Таким образом, вероятно, что среди изученных нами изолятов действительно отсутствуют изоляты, принадлежащие к SCG1, SCG4 и SCG7.

В 2007 году возникло предположение, что филогенетические группы SCG-3c SCG4 и SCG5SCG6 искусственно разбиты на независимые филогенетические линии в связи с тем, что для поиска маркерных мутаций использовались геномы филогенетически близких штаммов H37Rv и CDC 1551, принадлежащих к SCG-4 и SCG-6 [Gagneux S., Smal P., 2007]. Однако современные данные позволяют сделать вывод, что эти филогенетические линии являются эволюционно независимыми, хотя и достаточно близкими [Vultos T. et al., 2008]. Данные, полученные нами, также подтверждают гипотезу о независимости этих филогенетических линий, так как были обнаружены 152 изолята, принадлежащие к SCG5 и SCG6, но ни одного изолята, принадлежащего к SCG4. Отсутствие штаммов M. tuberculosis, принадлежащих к SCG-4, позволяет заключить, что группы SCG-4, SCG-5 и SCG-6 являются независимыми филогенетическими линиями.

Рисунок 4 – Дендрограмма генетического родства штаммов M. tuberculosis построенная на основании результатов секвенирования 89 генов (Comas 2009 c изменениями)

Это подтверждается также данными, полученными при секвенировании генов системы 3R клинических штаммов M. tuberculosis [Vultos T. et al., 2008], так как на дендрограмме, построенной с учётом результатов анализа генов этой системы, изоляты из этих SCG сформировали самостоятельные группы.

В то же время при анализе сполиготипов клинических изолятов M. tuberculosis не обнаружено однозначных закономерностей для всех сполигосемейств. Изоляты, относящиеся к сполигосемейству Т, принадлежали к трём разным кластерным группам – SCG-3, SCG-5 и SCG-6. Также на дендрограмме, построенной на основании данных, полученных при использовании метода MIRU-VNTR, изоляты, принадлежащие к SCG-3, оказались сгруппированными в две ветви – группу MIRU-VNTR-2 и группу MIRU-VNTR-4. Обе группы состояли из изолятов, относящихся к сполигосемействам Т и Haarlem. Однако мы не обнаружили совпадения сполиготипов у изолятов, входящих в эти две группы MIRU-VNTR, несмотря на то, что такое совпадение обнаружено у изолятов, входящих в группы MIRU-VNTR-2 (SCG-3) и MIRU-VNTR-3b (SCG-6). По данным секвенирования 89 генов M. tuberculosis [Comas I. et al., 2009] и секвенирования генов системы 3R [Vultos T. et al., 2008], штаммы, имеющие сполиготипы, принадлежащие к семейству Т, также находятся на разных эволюционных ветвях. Кроме того, только при анализе изолятов, принадлежащих к сполигосемейству Beijing, нами были обнаружены закономерности, согласно которым, изоляты, имеющие один сполиготип, формировали самостоятельные ветви на дендрограмме, построенной на основании анализа 35 локусов MIRU-VNTR. При анализе клинических изолятов, относящихся к другим сполигосемействам, такие однозначные закономерности обнаружены не были. Даже при анализе кластера, состоящего из 55 изолятов, имеющих одинаковый профиль MIRU-VNTR по данным анализа 35 локусов, обнаружено четыре различных сполиготипа – 777477607760771, 775740003760771, 777777607760771 и 7774000000760771, относящихся к разным сполигосемействам  (LAM 9, Т1, LAM9 и T1, соответственно). Такие закономерности свидетельствуют о том, что в области прямых повторов происходит конвергентная эволюция, связанная либо со встраиванием инсерционного элемента IS6110, либо с делециями, приводящими к утрате уникальных участков в этой области. Вероятно, у штаммов, принадлежащих к семейству Beijing, такие перестройки случаются редко и являются необратимыми, что обусловлено редукцией области прямых повторов. Эти данные позволяют заключить, что анализ точечных мутаций является наиболее надёжным методом для установления принадлежности штаммов M. tuberculosis к индивидуальным филогенетическим линиям.

Сопоставление данных, полученных при анализе клинических изолятов M. tuberculosis методами MIRU-VNTR и RFLP-IS6110, позволяет сделать заключение, что при дифференциации близкородственных штаммов метод RFLP-IS6110 имеет преимущество, так как в результате его использования близкородственные изоляты формируют кластеры меньшего размера. Однако тот факт, что в нескольких случаях обнаружено совпадение профилей RFLP-IS6110 у изолятов, относящихся к разным SCG и сполигосемействам, указывает на невозможность его использования в качестве основного метода генотипирования штаммов M. tuberculosis.

Рисунок 5 – Алгоритм генотипирования клинических изолятов M. tuberculosis

Мы предлагаем алгоритм генотипирования (рис. 5), включающий в качестве основных методов анализ штаммов методом MIRU-VNTR и анализ точечных мутаций, позволяющий выявить принадлежность изолята к конкретной SCG. Оба этих метода основаны на использовании полимеразной цепной реакции и анализе ампликонов в агарозном геле, что требует наличия минимальной приборной базы. При необходимости дифференцирования близкородственных штаммов в качестве дополнительного метода генотипирования может быть использован метод RFLP-IS6110.

Рисунок 6 – Группы клинических изолятов M. tuberculosis, обнаруженные на дендрограмме,

построенной на основанной данных MIRU-VNTR

Выводы.

1. Подобраны условия проведения анализа, позволяющие тестировать 35 локусов MIRU-VNTR, в том числе локусов, обладающих наибольшим полиморфизмом.

2. Показано, что клинические изоляты M. tuberculosis, выделенные от пациентов г. Тулы, распределились между SNP группами следующим образом: SCG-2 - 33,7%, SCG-3 - 14,1%, SCG-5 - 43,6% и SCG-6 - 8,6%.

3. Подтверждена самостоятельность филогенетических линий SCG-4, SCG-5 и SCG-6 M. tuberculosis.

4. Установлено, что все основные ветви дендрограммы, построенной для клинических изолятов M. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.) на основании результатов анализа 35 локусов MIRU-VNTR, соответствуют геногруппам, определённым на основании анализа точечных мутаций.

5. Выявлено, что клинические изоляты M. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.), принадлежащие к сполигосемействам Beijing, Haarlem и LAM, относятся к кластерным группам SCG-2, SCG-3 и SCG-5, соответственно, в то время как изоляты, принадлежащие к сполигосемейству Т, относятся к трём различным кластерным группам SCG-3, SCG-5 и SCG-6.

6. Показано, что совместное использование методов MIRU-VNTR и SNP позволяет проводить генетическую дифференциацию изолятов M. tuberculosis и определять их принадлежность к отдельным филогенетическим линиям.

7. Установлено, что метод MIRU-VNTR обладает преимуществом перед методом RFLP-IS6110 при выявлении изолятов M. tuberculosis, принадлежащих к одной клональной линии, в то время как метод RFLP-IS6110 обладает большей разрешающей способностью при анализе близкородственных изолятов M. tuberculosis.

8. Показано, что для клинических изолятов M. tuberculosis, относящихся к кластерным группам SCG-2 и SCG-5, характерны различные мутации, приводящие к формированию лекарственной устойчивости.

Публикации по теме диссертации.

  1. Богун А.Г., Майская Н. В., Онасенко А.Г., Степаншина В. Н., Шемякин И.Г. Характеристика мутаций гена pncA в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis, выделенных в Российской Федерации. Сборник тезисов. ” Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита “Группы восьми” и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств”, Материалы VII межгосударственной научно-практической конференции. Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г., с. 88
  2. Shemyakin I., Stepanshina V., Blagodatskikh S.A., Nizova A.V., Bogun A.G. Characteristics of M. tuberculosis isolates recovered in Central Russia. Abstract Book. 28th Annual Congress of the European Society of Mycobacteriology, July 1-4, 2007, Athens, Greece. P. 138.
  3. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Богун А.Г., Майорова А.А., Шемякин И.Г. Анализ устойчивости клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам первого и второго ряда.// Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2007. – 4. – C. 7-11.
  4. Shemyakin I., Nizova A., Maiskaya N., Bogun A., Maiorova A., Stepanshina V. Drug resistance profile of M. tuberculosis strains isolated in central Russia. Abstract Book. 38th World Conference on lung Health of the International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases (The Union). Cape Town, South Africa 8-12 November 2007, S173.
  5. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis. Сборник тезисов конференции "Молекулярная диагностика - 2007" (28-30 ноября 2007 год). C. 43-44.
  6. Богун А.Г., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Применение метода MIRU-VNTR для анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis. Сборник тезисов конференции "Молекулярная диагностика - 2007" (28-30 ноября 2007 год). C. 63-64.
  7. Богун А.Г., Майская Н.В., Степаншина В.Н., Шемякин И.Г. Оптимизация метода MIRU-VNTR для анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis. Биотехнология – 2008. – 4. – 80-86.
  8. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2008. – 4. – C. 23-36. Низова А.В., Степаншина В.Н., Майская Н.В., Миронова Р.И., Богун А.Г., Домотенко Л.В., Морозова Т.П., Шемякин И.Г. Определение устойчивости к пиразинамиду клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. – 2008. – 4. – C. 23-26.
  9. Богун А.Г., Шемякин И.Г., Степаншина В.Н. Комплексное исследование клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis молекулярно-генетическими методами. Материалы конференции Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека “Биологическая безопасность в современном мире” (21-22 апреля 2009, ФГУН ГНЦПМБ, Оболенск). С. 47-49.


 


Похожие работы:

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»






 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.