WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Суточная динамика биологических свойств staphylococcus aureus

На правах рукописи

Паромова Яна Игоревна

СУТОЧНАЯ ДИНАМИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

STAPHYLOCOCCUS AUREUS

03.02.03 – «Микробиология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оренбург - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному

развитию

Научный руководитель:

кандидат биологических наук,

доцент ГОУ ВПО

Тюменская государственная

медицинская академия Тимохина Татьяна Харитоновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

доцент

Институт клеточного

и внутриклеточного симбиоза

УрО РАН Карташова Ольга Львовна

доктор медицинских наук,

профессор ГОУ ВПО

Оренбургский государственный

университет Брудастов Юрий Авенирович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Росздрава

Защита состоится « » 2010 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03 при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА

Автореферат разослан «___» ____________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессор Немцева Наталия Вячеславовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для современного этапа развития медико-биологических наук характерен возрастающий интерес к закономерностям организации живого во времени. Ритмы охватывают все проявления живого – от деятельности субклеточных структур и отдельных клеток до сложных форм поведения организма, популяций и экологической системы. Это свидетельствует, что биоритмы являются универсальным и важнейшим свойством жизни (Агаджанян Н.А., Башкиров А.А., 1987; Арушанян Э.Б., 2000; Романов Ю.А., 2000; Halberg F., 1994, 2006). Изучение биоритмов открывает новые возможности в решении ряда медико-биологических проблем – механизмов гомеостаза, адаптации, чувствительности к лекарственным средствам, диагностики, лечения, профилактики заболеваний человека (Комаров Ф.И. с соавт., 2008; Aschoff J., 1985; Cornelissen G., 1993; Halberg F., 1991; Minors D.S., 1992). Поэтому чрезвычайно важным является обнаружение в живой системе ритмических колебаний различных жизненных процессов (Романов Ю.А., 2005; Ноздрин Г.А., 2006; Маркина В.В., 2008; Смирнов С.Н., 2008).

Биологические ритмы различных функций хорошо изучены у эукариотических клеток. Сведения же о биоритмах прокариот единичны, противоречивы, не систематизированы (Павлович Н.В., 1991; Капитанов Е.А., Жмакин А.И., 1992; Kippert F., Lloyd D., 1987; Lloyd A., Rossi E., 1992; Min H. et al., 2005).

Для изучения биоритмов прокариот нами в качестве модели был использован Staphylococcus aureus, который является уникальным микроорганизмом, колонизирующим и поражающим многие органы и ткани, демонстрируя при этом широкий диапазон адаптационных возможностей (Николаева И.В., 2000; Учайкин В.Ф., 2003; Габриэлян Н.И., 2004; Чернуха М.Ю., 2005; Кафарская Л.И., 2006, Флуер Ф.С., 2006; Поспелова С.В. с соавт., 2008). Успехи в изучении биологии стафилококков позволили относительно полно охарактеризовать механизмы и факторы, способствующие развитию инфекционной патологии у человека (Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Карташова О.Л., 2002).

Изучение ритмических колебаний различных функций стафилококков позволяет по-новому подойти к оценке биологических свойств возбудителя, способствуя разработке новых подходов к микробиологической диагностике стафилококковых инфекций, созданию предпосылок для дальнейших исследований по осуществлению рациональных антимикробных мероприятий.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - изучение особенностей биологических свойств S. aureus и влияние на них антимикробных препаратов в разное время суток.

Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Изучить биологические ритмы пролиферативной активности и патогенных характеристик (протеазной, каталазной, гемолитической, плазмокоагулазной активности) музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus в разное время суток.
  2. Определить чувствительность S. aureus к антимикробным препаратам с учетом индивидуальных особенностей их суточной динамики.
  3. Оценить влияние антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus.

Новизна исследования

Впервые представлена характеристика суточной динамики пролиферативной активности и патогенных свойств S. аureus. Обнаружены циркадианные ритмы пролиферативной активности у музейных штаммов S. аureus, в отличие от госпитальных изолятов, у которых выявлены преимущественно ультрадианные ритмы. У музейных штаммов S. аureus отмечены в основном циркадианные ритмы факторов патогенности с акрофазами протеазной, каталазной и плазмокоагулазной активности в утренние часы, гемолитической – в вечернее время. У госпитальных изолятов обнаружены ультрадианные ритмы данных факторов, с акрофазами в вечернее и ночное время. Полученные результаты, расширяя теоретические представления о различных периодах физиологической активности биологических свойств патогенов в течение суток, позволили разработать способ дифференциации госпитальных изолятов S. аureus от музейных штаммов (патент РФ № 2285258, от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).





Исследование гемолитической активности у госпитального изолята S. aureus, типированного как негемолитический вариант во временном аспекте, позволило выявить наличие данного признака в ночное время (02.00 час), что расширяет возможность лабораторной идентификации золотистых стафилококков.

Определена прямая корреляция между пролиферативной и гемолитической активностью и обратная корреляция между пролиферативной активностью и протеазной, каталазной, плазмокоагулазной активностью S. aureus в течение суток, что указывает на способность микроорганизмов в период минимальной пролиферации более успешно противостоять факторам защиты организма хозяина за счет максимального количества факторов патогенности (протеазы, каталазы, плазмокоагулазы).

Обнаружена суточная динамика чувствительности к антимикробным препаратам музейных и госпитальных изолятов S. aureus. Определено варьирование минимальных подавляющих концентраций (МПК) дезинфектантов в разное время суток. Выявлены периоды резистентности к антибиотикам у музейных (чувствительных к препаратам) штаммов S. aureus и периоды чувствительности у госпитальных (антибиотикорезистентных) изолятов в течение суток.

Установлено модулирующее влияние антимикробных препаратов на пролиферативную и плазмокоагулазную активность S. аureus. Показано изменение среднесуточного значения показателей, колебание амплитуды, смещение акрофазы под действием антимикробных препаратов, что свидетельствует о возможностях микроорганизма адаптироваться к изменяющимся условиям путем координации и регуляции собственных ритмометрических параметров и синхронизации их с внешними циклами.

Научно-практическая значимость

Выявленные биоритмы пролиферативной активности, факторов патогенности, их взаимосвязь в суточной динамике, лабильность биоритмов под влиянием антимикробных препаратов расширяют теоретические представления о физиологии биологических свойств S. аureus, его способности к адаптации в изменяющихся условиях среды.

Практическое значение исследований определяется разработкой хронобиологического метода изучения пролиферативной активности S. аureus, позволяющего дифференцировать госпитальные изоляты микроорганизмов на основе сравнительного анализа суточной динамики данного биологического свойства S. aureus.

Хронобиологические исследования определили новый методический подход к изучению временной организации биологических свойств прокариот на модели S. аureus, что позволило выявить различные суточные периоды активности патогенных свойств микробных культур, чувствительности к антибиотикам и дезинфектантам, а также генетически детерминированные признаки, не определяемые традиционными методами.

Предложенный методический подход к изучению биологических свойств S. aureus может быть рекомендован для идентификации S. aureus и дальнейших исследований в области рациональной антимикробной терапии, а также использован в учебно-педагогическом процессе (акт внедрения результатов диссертационной работы № 01/1928 от 06.09.2010 г.).

Положения, выносимые на защиту:

  1. Госпитальные изоляты S. aureus имеют преимущественно ультрадианные ритмы пролиферативной активности, факторов патогенности, в отличие от музейных штаммов, для которых характерны циркадианные ритмы.
  2. Хронобиологический подход изучения биологических характеристик S. aureus выявляет различные суточные периоды активности патогенных культур в отношении их устойчивости к антимикробным препаратам.

Апробация работы





Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2006); научной сессии, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН «Медицинская академическая наука – здоровью населения Урала» (Челябинск, 2008); выездной сессии Президиума РАМН (Челябинск, 2009); заседании Тюменского филиала Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (ВНПОЭМП), Тюмень, 2009.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент (№ 2285258, от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

Объем и структура диссертационной работы

Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 129 отечественных и 100 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 16 таблицами и 32 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для исследования биоритмов пролиферативной активности, факторов патогенности, чувствительности к антибиотикам и дезинфектантам были использованы музейные штаммы S. aureus, полученные из американской коллекции типовых культур (АТСС) - № 25923, государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А. Тарасевича - № 209-Р и клинические изоляты S. aureus (№№ 2305, 2888, 2891), выделенные из раневого отделяемого пациентов ожогового центра Областной клинической больницы г. Тюмени. Выделение и идентификацию S. aureus проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, фаголизабельных свойств в соответствии с приказом МЗ СССР № 535 от 22.04.85 г. Изоляты S. aureus, выделенные из клинического материала, обладали множественной лекарственной устойчивостью, и были идентифицированы как госпитальные.

Биоритмы пролиферативной активности S. aureus изучали многократно по разработанной нами методике проведения биоритмологического эксперимента и обработке данных, учитывающих особенности работы с микроорганизмами. Пролиферативная активность оценивалась по общему микробному числу (ОМЧ). Для исследований были получены 12-ти часовые культуры, что соответствовало началу стационарной фазы развития бактерий. Каждое суточное исследование включало 8 контрольных точек. Через 3 часа в течение суток проводили высев исследуемой культуры на ОМЧ (патент на изобретение «Способ диагностики госпитальных штаммов» № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28).

Активность плазмокоагулазы изучали, используя стандартную методику с цитратной плазмой кролика (Клиническая лабораторная аналитика/ Под ред. В.В. Меньшикова, 2003).

Активность протеазы определяли по убыли альбумина после инкубации с исследуемыми штаммами биуретовым методом (Практикум по микробиологии/ Под ред. А.И. Нетрусова, 2005).

Активность каталазы определяли фотометрическим методом по убыли пероксида водорода (Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., 2000), гемолитическую активность по методике (Бухарин О.В. и др., 2006).

Чувствительность к антибиотикам исследуемых культур проводили с использованием диагностических панелей для идентификации грам-положительных микроорганизмов: MicroScan “Pos Combo Type 41” фирмы Dade Behring (USA) фирмы Dade Behring (USA) на бактериологическом анализаторе «Autoscan» фирмы «Baxter» (USA).

Влияние антибиотиков и дезинфектантов на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus определяли, взяв за основу стандартную методику серийных разведений, используя МПК (Клиническая лабораторная аналитика /Под ред. В.В. Меньшикова, 2003)

Результаты исследований получены на основе анализа суточной динамики изучаемых биологических свойств штаммов S. aureus в течение 3 лет.

Данные по биологическим свойствам S. aureus подвергали статистической обработке с определением средних значений (М), средней ошибки средней арифметической (m) в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003. Сравнительный анализ биологических свойств между музейными и госпитальными штаммами проводили с использованием критерия Манна-Уитни (Т). Данные были обработаны также по методу наименьших квадратов (косинор-анализ) при заданной значимости достоверности p<0,05, с целью поиска ритмов (ультрадианный ритм – длина периода до 20 часов, циркадианный ритм – длина периода 20-28 часов (околосуточный), МЕЗОРА (среднесуточное значение), амплитуды (величина наибольшего отклонения полезного сигнала от МЕЗОРа), акрофазы, момента времени, соответствующего регистрации максимального значения полезного сигнала (Nelson W. et al., 1979). Взаимосвязь между биоритмами пролиферативной активности и биоритмами факторов патогенности S. aureus анализировали с использованием программы «корреляционный анализ» Microsoft Excel 1997. Данные по определению влияния антимикробных препаратов на биологические свойства S. aureus были подвергнуты статистической обработке непараметрическим методом с применением критерия Уилкоксона (W). Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение

Обнаружена суточная динамика пролиферативной активности изучаемых музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus. При оценке временных параметров музейных штаммов S. aureus 25923 и 209-Р установлены статистически значимые биоритмы пролиферативной активности со стабильными положениями акрофаз. Проведенное сопоставление акрофаз показало, что у музейных штаммов S. aureus максимальные значения этого показателя наблюдались в вечернее и ночное время, минимальные - в утренние часы (рис. 1). Ритмометрический анализ выявил у музейных штаммов S. aureus 209-Р и 25923 ведущий циркадианный ритм – околосуточный (вклад ритма 38,4% и 56,1%, амплитуда 37,9±7,9 и 39,9±6,8, соответственно, р<0,05). У госпитальных изолятов S. aureus 2305, 2888 и 2891 наблюдалось смещение акрофаз от соответствующих параметров музейных штаммов, максимальная пролиферативная активность проявлялась и в дневное, и в вечернее время (рис. 2). На основании ритмометрического анализа установлено преобладание ультрадианных ритмов (период менее 20 часов) пролиферативной активности, отличающихся различными вкладами в общий спектр. Изолят S. aureus 2305 характеризовался 12-ти часовым периодом ритма (вклад ритма 44,0%, амплитуда 31,4±3,9, р<0,05); у S. aureus 2891 также был выявлен ритм с периодом 12 часов, но с меньшим процентным вкладом – 17,8%, амплитуда 25,4±8,9, р<0,05, у S. aureus 2888 12-ти часовой период ритма характеризовался низким вкладом – 15,6% (р>0,05), для этого изолята достоверным оказался период, близкий к 8-ми часовому (вклад 74,6%, амплитуда 41,8±16,4, р<0,05).

Рис. 1 - Суточная пролиферативная активность музейных штаммов S. aureus

Рис. 2 - Суточная пролиферативная активность госпитальных изолятов

S. aureus

Таким образом, музейные штаммы S. aureus обладали достоверным циркадианным ритмом, высокой амплитудой ритма, акрофазой в одно и то же время, что говорит о стабильности их ритма. Госпитальные штаммы характеризовались гетерогенностью ритмов, по всей видимости, сформировавшейся под влиянием внешних факторов. Преобладание того или иного ритма было явно выражено и, можно сказать, являлось типовым признаком в хроноструктуре изученных временных рядов пролиферативной активности данных штаммов (рис. 3).

Различия ритмометрических параметров пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов S. aureus, включая вклады циркадианных, ультрадианных ритмов и амплитуды, имеют значение для дифференциации госпитальных изолятов S. aureus (патент № 2285258 от 10.10.2006 г.).

Рис. 3 - Спектральный состав биоритмов пролиферативной активности

S. aureus

По оси абсцисс - музейные штаммы: 25923, 209;

госпитальные: 2305, 2888, 2891; по оси ординат – вклад ритмов ( %)

- р<0,05 – достоверные вклады ритмов

На следующем этапе работы исследовали суточную динамику патогенных свойств S. aureus, в частности, плазмокоагулазную, протеазную, каталазную, гемолитическую активность и проводили сопоставление этих показателей с пролиферативной активностью S. aureus. В литературе мы обнаружили лишь единичные сведения о биоритмах биохимической активности микробов, изменяющихся в зависимости от солнечной активности, фазы Луны и смены сезонов (Павлович Н.В., 1991, Поликарпов Н.А., 1995). В результате проведенных исследований обнаружено, что музейные штаммы S. aureus 25923 и 209-Р характеризовались достоверным циркадианным ритмом плазмокоагулазной активности с акрофазой в 11.00 часов, минимальная активность наблюдалась в вечерние и ночные часы – 17.00 и 23.00 часа. У госпитальных изолятов, напротив, отмечался ультрадианный ритм с акрофазами в 2.00 и 14.00 часов (рис.4). Результаты исследований показали, что время коагуляции плазмы госпитальными изолятами было достоверно меньше, чем время коагуляции музейными штаммами S. aureus (Т = 36, р<0,05), т.е. госпитальные изоляты характеризовались более высокой плазмокоагулазной активностью. Отработанные оптимальные условия оценки активности плазмокоагулазы штаммов S. aureus можно использовать для индикации госпитальных изолятов стафилококков, которые обладают более ранней по времени плазмокоагулазной активностью, по сравнению с негоспитальными штаммами.

Рис. 4 – Суточная динамика плазмокоагулазной активности S. aureus

У музейного штамма S. aureus 25923 обнаружен циркадианный и ультрадианный ритм протеазной и каталазной активности с акрофазами в утренние часы – 5.00, 11.00 часов (максимальные значения - 4,1±0,02 мг/минмл и 6,2±0,1 мкмоль/мин, соответственно). Гемолитическая активность музейного штамма характеризовалась циркадианным ритмом с акрофазой в вечернее время – 23.00 часа (20,1±0,2 %).

У госпитального изолята 2888 выявлен ультрадианный ритм протеазной, каталазной активности с акрофазами в вечерние и ночные часы (рис. 5, 6). Интерес представляет тот факт, что госпитальный изолят S. аureus был типирован как негемолитический, но исследуя это свойство в разное время суток, мы выявили наличие гемолитической активности у данного изолята с максимальными значениями в ночное время – 2.00 часа (рис.7). Вероятно, хронобиологический подход позволяет выявлять те генетически детерминированные признаки S. аureus, которые не могут быть определены традиционными методами. Отмечено, что наибольшей среднесуточной активностью протеазы, каталазы, гемолизина характеризовался музейный штамм S. аureus (протеаза - 2,3±0,03 мг/минмл, госпитальный изолят 0,4±0,03 мг/минмл, р<0,05; каталаза - 3,4±0,1 мкмоль/мин, госпитальный изолят - 2,7±0,7 мкмоль/мин, р>0,05; гемолизины - 14,7±0,1%, госпитальный изолят – 4,7±0,1%, р<0,05).

Сравнительный анализ позволил выявить корреляцию между пролиферативной активностью и патогенными характеристиками S. аureus. У музейного штамма S. аureus показатели пролиферативной активности положительно коррелировали с гемолитической активностью (r = 0,38; p<0,05), но отрицательно коррелировали с каталазной активностью (r = -0,58; p<0,05), протеазной активностью (r = -0,60; p<0,05) и плазмокоагулазной активностью (r = -0,81; p<0,05). Т.е. в период минимальной пролиферативной активности стафилококков продукция ферментов (плазмокоагулазы, протеазы, каталазы) была максимальна выражена, что может способствовать выживанию патогенов в организме хозяина. С увеличением пролиферативной активности максимальных значений достигала продукция повреждающих факторов - гемолизинов.

У госпитального изолята S. аureus была выявлена положительная корреляция пролиферативной активности с каталазной активностью (r = 0,57; p<0,05) и отрицательная с плазмокоагулазной активностью (r = -0,91; p<0,05). С протеазной и гемолитической активностью четкой корреляции выявлено не было (r = -0,07; p>0,05; r = -0,29; p>0,05, соответственно), хотя в период минимальной пролиферативной активности наблюдали увеличение продукции протеазы и гемолизинов.

Полученные данные не противоречат существующему принципу попеременной (асинхронной) работы структур организма (Комаров Ф.И., 1989) и, вероятно, отражают стратегию распределения патогенных ресурсов микроорганизмов. Так, при интенсивном функционировании той или иной системы функциональная активность многих других систем снижается: в одной и той же клетке адаптивная интенсификация синтеза одних ферментов обязательно сопровождается ингибированием продукции других. Это свидетельствует о том, что организму свойственна способность экономии материальных ресурсов и максимальная концентрация их на главном участке развертывания приспособительной реакции в каждый данный момент (Лукомская К.А., 1987; Комаров Ф.И., 2000).

Выявленные циркадианные и ультрадианные ритмы пролиферативной активности и факторов патогенности у S. aureus подтверждают высказывания авторов, что ритмы присущи всему живому (Агаджанян Н.А., Башкиров А.А., 1987; Арушанян Э.Б., 2000) и согласуются с работами немногих авторов, также обнаруживших наличие биоритмов в прокариотической клетке (Капитанов Е.А., Жмакин А.И., 1992; Kippert F., 1987; Lloyd L., 1992; Johnson С.Н., 2005; Smith R., 2006).

Исследования суточной динамики чувствительности S. aureus к некоторым антибиотикам позволили обнаружить различные МПК антибиотиков в отношении музейного штамма S. aureus 25923. Максимальная чувствительность к большинству изученных антибиотиков (амоксиклав, имипенем, ванкомицин, гентамицин, рифампицин, тетрациклин, клиндамицин) зарегистрирована в раннее утреннее время - 5.00 часов и вечернее время – 20.00; 23.00 часа. Были выявлены периоды повышения МПК антибиотиков и приближение этих значений к показателям резистентности в утреннее и дневное время – 8.00; 11.00; 14.00 часов.

Госпитальный изолят S. aureus 2888 отличался колебаниями к меньшему количеству антибиотиков в течение суток. К большинству препаратов изолят был резистентен. Динамика чувствительности была отмечена только к следующим антибиотикам: линезолид, цефалотин, гатифлоксацин, моксифлоксацин, синерцид. МПК цефалотина, линезолида выявлена в 2.00 и 5.00 часов, МПК моксифлоксацина наблюдалась в 5.00; 20.00 и 23.00 часа, МПК гатифлоксацина – на всем протяжении суточного ритма, кроме 2.00 и 8.00 часов, МПК синерцида выявлена в 2.00; 5.00 и 23.00 часа. Следовательно, у госпитального изолята, напротив, были отмечены периоды чувствительности к антибиотикам в течение суток.

Выявлена суточная динамика чувствительности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus к пероксимеду, хлорамину. МПК хлорамина – 0,19% при 60 мин экспозиции с культурой музейного штамма S. aureus определена в 2.00 и 23.00 часа, с культурой госпитального изолята S. aureus - в 2.00 часа; МПК пероксимеда – 1,5% – в 11.00 часов для музейного штамма, в 23.00 часа – для госпитального изолята S. aureus.

Таким образом, различная чувствительность S. aureus к антибиотикам и дезинфектантам в течение суток может иметь значение, как для идентификации штаммов, так и для дальнейших исследований в области рациональной антибиотикотерапии и проведении дезинфекционных мероприятий.

Учитывая, что при взаимодействии микроорганизмов с различными стрессовыми факторами (антисептики, метаболиты, алкилоксибензолы и др.), возможны изменения численности популяции, стрессоустойчивости, факторов патогенности (Красильников А.П., 1994; Сузина Н.Е., 2001; Эль-Регистан Г.И., 2001; Ильинская О.Н., 2002; Бухарин О.В., Сгибнев А.В., 2002; Иванова Е.Б., 2004), мы предприняли попытку изучить модулирующее влияния антимикробных препаратов на биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus.

Влияние суббактериостатических концентраций пероксимеда на пролиферативную активность музейных штаммов S. aureus 209-Р и 25923 проявлялось снижением мезора, амплитуды ритмов, смещением акрофазы на дневное и утреннее время, а у штамма 209-Р изменением циркадианного профиля биоритма на ультрадианный. Таким образом, у музейных штаммов наблюдался десинхроноз ритма, который характеризовался изменением всех ритмометрических параметров, существенным смещением акрофаз (асинхронностью), вплоть до противофазности, что свидетельствует о снижении адаптационных возможностей культур.

На биоритмы пролиферативной активности госпитальных изолятов S. aureus пероксимед оказывал меньшее воздействие. Достоверно снижалось только среднесуточное значение (W = 36, р<0,05), все остальные параметры ритма (вклады, акрофаза, амплитуда) оставались близкими к контрольным значениям.

Влияние суббактериостатической концентрации пероксимеда на плазмокоагулазную активность в разное время суток проявлялось у музейных штаммов S. aureus 25923 и 209-Р увеличением времени коагуляции плазмы (контроль 66,0±0,6 мин и 74,8±0,7 мин, через 15 мин экспозиции – 146,1±0,7 мин и 228,5±1,6 мин, через 30 мин - 164,8±0,7 мин и 263,7±1,6 мин, соответственно), смещением акрофазы, увеличением вклада циркадианного ритма с сильным увеличением амплитуды (контроль 7,6±0,7 мин, через 15 мин экспозиции - 48,3±3,0 мин, через 30 мин - 60,0±3,6 мин), что свидетельствует об адаптивном напряжении изучаемых штаммов S. aureus.

В течение суток выявлены периоды (2.00; 5.00; 8.00; 14.00 часов), когда время коагуляции плазмы музейными штаммами S. aureus после 30 мин экспозиции с пероксимедом не отличалось от времени коагуляции после 15 минутной экспозиции (W = 20, р>0,05), а в некоторых случаях было даже меньше. Т.е. более длительная экспозиция с небольшими концентрациями дезинфектанта способствовала адаптации патогена, что проявлялось в увеличении плазмокоагулазной активности.

У госпитальных изолятов S. aureus 2305 и 2888 также наблюдалось увеличение времени коагуляции плазмы под воздействием пероксимеда (контроль 47,3±0,5 и 50,0±0,5 мин; после 15-ти минутной экспозиции с пероксимедом - 111,0±0,7 и 116,6±0,4 мин; после 30-ти минутной экспозиции -143,0±0,6 и 155,7±0,5 мин, соответственно), хотя и в меньшей степени, чем у музейных штаммов.

Под воздействием суббактериостатических концентраций гентамицина у музейного штамма S. aureus (гентамицинчувствительный) изменились ритмометрические параметры: уменьшился вклад циркадианного ритма, появился ультрадианный ритм, снизился среднесуточный показатель пролиферативной активности, амплитуда ритма, изменилась акрофаза (р<0,05), т.е. наблюдалась десинхронизация. Изменения биоритмов пролиферативной активности музейного штамма S. aureus свидетельствуют о снижении адаптационных возможностей микроба и необратимых изменениях, в дальнейшем приводящих культуру к гибели.

У госпитального изолята S. aureus (гентамицинрезистентного) достоверных изменений при таком же режиме воздействия гентамицином не выявлено (р>0,05). Отсутствие изменений может быть использовано для дифференциации госпитальных изолятов от музейных штаммов.

Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на пролиферативную активность S. aureus было установлено изменение ритмометрических показателей, как у музейного штамма, так и у госпитального изолята (W = -34; - 30, соответственно, р<0,05). Увеличивалось среднесуточное значение пролиферативной активности у музейного и госпитального штаммов (ванкомицинчувствительных) по сравнению с контролем в 3 раза (с 107,0±3,2 КОЕ/мл до - 321,5±7,4 КОЕ/мл и с 126,4±2,3 КОЕ/мл до 354,5±3,8 КОЕ/мл, соответственно). У музейного штамма появился ультрадианный ритм. Акрофаза пролиферативной активности музейного штамма сместилась с ночного периода на утро, у госпитального изолята акрофаза роста отмечалась в 14.00 и 20.00 часов, в отличие от контроля с максимумами в 5.00; 14.00 и 23.00 часа. У обоих штаммов отмечено сильное увеличение амплитуды ритма (у музейного - с 26,6 КОЕ/мл до 87,6 КОЕ/мл; у госпитального с 14,2 КОЕ/мл до 130,9 КОЕ/мл), что свидетельствует о сильном адаптивном напряжении, попытке стабилизировать внутреннее состояние после стрессового воздействия ванкомицина.

Под действием суббактериостатических концентраций ванкомицина на плазмокоагулазную активность S. aureus выявлено уменьшение времени коагуляции плазмы музейным штаммом и госпитальным изолятом (W = 36, р<0,05). Все остальные ритмометрические параметры не отличались от контрольных значений (без воздействия антибиотика). Выявленные особенности суббактериостатических концентраций ванкомицина усиливать плазмокоагулазную активность, а также стимулировать рост микроба, способствуя увеличению численности S. aureus, необходимо учитывать при рациональной антибиотикотерапии.

Таким образом, обнаруженные изменения биологических ритмов различных свойств S. aureus под влиянием антимикробных препаратов подтверждают высказывания ряда авторов о том, что это отражает адаптационные возможности патогена, т.к. биологический ритм все время подстраивается к новой среде обитания, чтобы дать организму максимальную возможность адаптироваться к окружающей среде путем синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами (Агаджанян Н.А., 1998; Губин Д.Г., 1989; Смирнов В.М., 2002; Маркина В.В., Романов Ю.А., 2005).

Ритмометрические параметры, как наиболее чувствительные, первыми реагируют на влияние какого-либо фактора окружающей среды. Это позволяет выявить информативные биоритмологические критерии для оценки наиболее ранних изменений показателей физиологической активности, а также определить механизмы адаптивных реакций микробов на действие различных факторов.

Результаты проведенной работы позволили выделить два основных момента:

- для музейных штаммов S. aureus характерны преимущественно циркадианные ритмы пролиферативной активности, патогенных свойств, чувствительности к антибиотикам в отличие от госпитальных изолятов, для которых основными являлись ультрадианные ритмы;

- антимикробные препараты изменяли биоритмы пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus в отношении их устойчивости к препаратам, отражая потенциальную возможность патогена к адаптации в изменяющихся условиях существования.

ВЫВОДЫ:

  1. Определены особенности ритмов биологических свойств у музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus: циркадианная динамика пролиферативной, протеазной, каталазной, плазмокоагулазной, гемолитической активности у музейных штаммов и ультрадианные ритмы этих характеристик у госпитальных изолятов.
  2. Выявленные различия в хроноинфраструктуре ритмов пролиферативной активности музейных штаммов и госпитальных изолятов позволили разработать метод дифференциальной диагностики госпитальных изолятов S. aureus.
  3. Хронобиологический подход позволил выявить генетически детерминированный признак - гемолитическую активность госпитального изолята S. aureus, типированного традиционным методом как гемолитически негативный вариант.
  4. Установлена прямая корреляция между пролиферативной и гемолитической активностью музейного штамма S. aureus и обратная корреляция между пролиферативной и протеазной, каталазной, плазмокоагулазной активностью. У госпитального изолята S. aureus пролиферативная активность находилась в прямой корреляции с каталазой и обратной с плазмокоагулазой.
  5. Установленные различия чувствительности музейных штаммов и госпитальных изолятов S. aureus к антибиотикам и дезинфектантам в течение суток могут иметь значение для дальнейших исследований в области рациональной антибиотикотерапии и проведении дезинфекционных мероприятий.
  6. Продемонстрирована принципиальная возможность изменения биологических ритмов пролиферативной и плазмокоагулазной активности S. aureus под воздействием антимикробных препаратов: под действием пероксимеда и гентамицина отмечены изменения ритмометрических параметров у музейных штаммов; суббактериостатические концентрации ванкомицина приводили к изменению этих параметров, как музейных штаммов, так и госпитальных изолятов S. aureus.
  7. Выявление суточной динамики биологических свойств определяет возможность нового подхода к изучению адаптивного потенциала микроорганизмов.

Список публикаций:

  1. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов/ Я.И. Паромова, Т.А. Сергеева, Г.Н. Чередниченко, В.М. Ниязов // Материалы XXXVIII Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной и клинической медицины». - Тюмень, 2004. - С. 56-57.
  2. Суточная динамика биохимической активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов под действием пероксимеда/ Я.И. Паромова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Г.Н. Иванова, М.В. Николенко // Медицинская наука и образование Урала, 2005. № 5. - С. 86.
  3. Адаптивный потенциал Staphylococcus aureus при госпитальных инфекциях/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович, Э.А. Кашуба, М.В. Николенко, Р.М. Хохлявина, Г.Н. Иванова // Медицинская наука и образование Урала, 2006. № 2. - С. – 94-103.
  4. Биоритмы пролиферативной активности музейных и госпитальных штаммов микроорганизмов/ Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Э.А. Кашуба, Д.Г. Губин, Р.М. Хохлявина, М.В. Николенко // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2007. № 4. - С. 3-5.
  5. Временная организация биологических свойств STAPHYLOCOCCUS AUREUS/ Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Н.А. Курлович, Н.Б. Перунова, С.Л. Галян, Т.Х. Тимохина // Медицинская наука и образование Урала, 2008. № 2. - С. 56-57.
  6. Суточные биоритмы антибиотикорезистентности, плазмокоагулазной и антилизоцимной активности Staphylococcus aureus/ Н.Б. Перунова, С.Б. Фадеев, Я.И. Паромова, Т.Х. Тимохина и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008. № 3. - С. 6-9.
  7. Биоритмы биологических свойств Staphylococcus aureus как фактор их адаптации при госпитальной инфекции/ Т.Х. Тимохина, В.В. Варницына, Я.И. Паромова, Н.А. Курлович, М.В. Николенко, Э.А. Кашуба // Медицинская наука и образование Урала, 2009. № 3. - С. 118-119.
  8. Биологические свойства доминирующих микроорганизмов в отделениях хирургического профиля/ Т.Х. Тимохина, М.В. Николенко, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, А.А. Барадулин // Медицинская наука и образование Урала, 2010. № 2. - С. 100-101.

Патенты:

Способ диагностики госпитальных штаммов /Э.А. Кашуба, Т.Х. Тимохина, Н.А. Курлович, Я.И. Паромова, В.В. Варницына, Р.М. Хохлявина, Д.Г. Губин, Л.Б. Козлов // Патент РФ на изобретение № 2285258 от 10.10.2006 г. Бюл. № 28.

Список сокращений:

АТСС – American Type Culture Collection (американская коллекция типовых культур)

КОЕ – колониеобразующая единица

ОМЧ – общее микробное число

ПЛК – плазмокоагулаза

МПК – минимальная подавляющая концентрация

С – концентрация

r – коэффициент ранговой корреляции Спирмена

T – критерий Манна-Уитни

W – критерий Уилкоксона

ПАРОМОВА ЯНА ИГОРЕВНА

Суточная динамика биологических свойств Staphylococcus aureus

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003

Подписано в печать 19.10.2010

Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.

Бумага офсетная. Гарнитура Times/

Тираж 100 экз.



 


Похожие работы:

«ВАСИЛЬЕВА ЕКАТЕРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭПИЗООТОЛОГИЯ ТРЕМАТОДОЗОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СИСТЕМЫ ПРОТИВОТРЕМАТОДОЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ В РЕСПУБЛИКЕ АЛТАЙ Специальность 03.02.11 - Паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень – 2010 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Российской академии сельскохозяйственных наук Научный...»

«Агафонкина Татьяна Всеволодовна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА И ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЦЕОЛИТСОДЕРЖАЩИМ ТРЕПЕЛОМ 03.00.25. – Гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2006 Работа выполнена в Чувашском государственном университете им. И.Н. Ульянова Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор МЕРКУЛОВА Лариса Михайловна Официальные оппоненты:...»

«Миняев Михаил Владимирович Комплексное моделирование процесса измерения биохимического потребления кислорода в жидких инкубационных средах 03.00.04 - биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь - 2007 Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Ворончихина Людмила Ивановна Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Лапина...»

«ЛЕВЧЕНКО МИХАИЛ АЛЕКСЕЕВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ НОВЫХ ИНСЕКТИЦИДОВ И ОПРЫСКИВАЮЩЕЙ ТЕХНИКИ ПРИ ДЕЗИНСЕКЦИИ ЖИВОТНОВОДЧЕСКИХ ПОМЕЩЕНИЙ ПРОТИВ МУХ Специальность 03.00.19 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Тюмень 2009 Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО Россельхозакадемии Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«Скибо Юлия Валерьевна РЕГУЛЯЦИЯ I И II ТИПОВ ПРОГРАММИРОВАННОЙ КЛЕТОЧНОЙ ГИБЕЛИ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПРИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена в НИЛ биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Абрамова Зинаида Ивановна Научный...»

«СОДЕРЖАНИЕ НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ 2 Сельское хозяйство 2 Почвоведение 2 Растениеводство 2 Защита растений 2 Животноводство 2 Ветеринария 3 Механизация и электрификация сельского хозяйства 3 Экономика сельского хозяйства 4 Пищевая промышленность 5 Биологические науки 5 Естественные и точные науки 5 Общественные науки 5 Охрана окружающей среды 5 НОВЫЕ...»

«Терехова Юлия Борисовна Молекулярные маркёры сифилитической инфекции 03.00.07 — микробиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва — 2008 Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова. Научный руководитель:...»

«Золотарева Наталья Владимировна Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами Пирацетам, Зорекс и Унитиол 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тверь – 2011 Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«ШУКЛИНА ЕВГЕНИЯ ВАСИЛЬЕВНА ОСОБЕННОСТИ ЭПИЗООТОЛОГИИ И СИСТЕМА ЛЕЧЕБНО – ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ ПРИ АССОЦИАТИВНОЙ ИНВАЗИИ МАРАЛОВ 03.00.19 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Барнаул 2007 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор,...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ Авторефераты Январь-2013 1. Аббасова, Самира Фуад кызы. Возможности видеоэндоскопического хирургического лечения хронического калькулезного холецистита у лиц пожилого возраста : автореферат диссертации. кандидата медицинских наук : 14.01.17 / С. Ф. Аббасова ; Российский университет дружбы народов (М.), кафедра госпитальной хирургии. - М. : б. и., 2013. - 19 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1). 2.

«Гайдышев Альберт Игоревич ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА И КИНЕТИКИ СОКРАТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ГОЛЕНИ В УСЛОВИЯХ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия им. академика Г.А. Илизарова Министерства здравоохранения и социального...»

«ШИШКИН ЯКОВ СЕРГЕЕВИЧ Снижение экологической нагрузки полигонов ТБО на объекты гидросферы на завершающих этапах жизненного цикла 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Пермь 2007 Работа выполнена в Пермском государственном техническом университете Научный руководитель: доктор технических наук, доцент Глушанкова Ирина Самуиловна Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Басов Вадим Наумович кандидат...»

«Сабарайкина Светлана Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ КРАСНЫХ СМОРОДИН ПОДРОДА RIBESIA L. В УСЛОВИЯХ ЯКУТИИ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2009 Работа выполнена в филиале Ботанический сад Института биологических проблем криолитозоны СО РАН. Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Сорокопудов Владимир Николаевич кандидат...»

«ЕЛИСТРАТОВА Людмила Леонтьевна КЛИНИКО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АКНЕПОДОБНЫХ ДЕРМАТОЗОВ, ОСЛОЖНЕННЫХ ДЕМОДЕКОЗОМ 03.02.03 – Микробиология 14.01.10 – Кожные и венерические болезни АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Ульяновский государственный университет Министерства здравоохранения...»

«ГАЕВСКАЯ НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ХОЛЕРНЫХ И ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Ростов-на-Дону 2013 Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«Нестеров Алексей Вячеславович Очистка нефтесодержащих сточных вод сочетанием экстракционных и адсорбционных методов Специальность 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Иваново 2008 г. Работа выполнена на кафедре химии ГОУВПО Брянская государственная инженерно-технологическая академия Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Пашаян Арарат Александрович Официальные оппоненты: доктор технических наук,...»

«Блохина Светлана Викторовна ЭПИЗО ОТО ЛОГИЯ ЦИСТНО ГО ЭХИНОКОККОЗ А В ОМСКОЙ О Б ЛАСТИ 03.00.19 - паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тюмень - 2009 Работа выполнялась в ФГУ ВПО Омский государственный аграрный университет и в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной энтомологии и арахнологии СО...»

«Суфияров Ринат Сабитович КОМПЛЕКСНАЯ ПРОФИЛАКТИКА, ДИАГНОСТИКА И ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННЫХ ГНОЙНО- ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 14.01.17. – ХИРУРГИЯ 03.02.03- микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук УФА – 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального...»







Загрузка...



 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.