WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Pages:   || 2 |

Полигостальность условно-патогенных энтеробактерий на модели их взаимодействия с растениями

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МАРКОВА

Юлия Александровна

ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ

УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ

03.02.03-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Иркутск – 2013

Работа выполнена в ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

ГБОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

профессор, заслуженный деятель науки РФ Савилов Евгений Дмитриевич

доктор биологических наук,

профессор Войников Виктор Кириллович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Иннокентьева Тамара Ивановна

(научный сотрудник лаборатории трансмиссивных инфекций, ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН)

доктор биологических наук,

профессор Огарков Борис Никитович

(заведующий кафедрой микробиологии ФГБОУ ВПО ИГУ)

доктор биологических наук Цивилева Ольга Михайловна

(старший научный сотрудник лаб. микробиологии, Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН)

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «___» июня в _____ часов на заседании Диссертационного Совета ДМ 001.038.01 при Научном центре проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН по адресу: г. Иркутск, ул. К. Маркса, 3. Почтовый адрес: 664025, г. Иркутск, а/я 539.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра проблем здоровья семьи и репродукции человека СО РАМН.

Автореферат разослан «___»_________ 2013 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

кандидат медицинских наук Кулеш Д. В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Инфекционные болезни по-прежнему занимают лидирующие позиции среди причин смертности во всем мире (Брико Н. И. с соавт., 2010). Среди них значительная роль принадлежит острым кишечным инфекциям (ОКИ) (Сергиев В. П. с соавт., 2000; Newell D. G. et al., 2010). В настоящее время среди возбудителей этой группы заболеваний все большее медицинское значение приобретают условно-патогенные энтеробактерии (УПЭ) (Бондаренко В. М., 2011; Анганова Е. В., 2012 и др.).

УПЭ, как правило, характеризуются значительной экологической пластичностью, что создает предпосылки для их убиквитарного распространения. К настоящему времени установлена возможность существования указанных бактерий в воде, почве, а также в растительном материале (Сомов Г. П., 2004; Бузолева Л. С., 2011; Пушкарева В. И. с соавт., 2012; Korzeniewska E., et al., 2012).

Обитание во внешней среде может привести к усилению вирулентности патогенов за счет горизонтального переноса генов (Stecher B. et al., 2012). Благоприятные условия для этого процесса создаются в местообитаниях, характеризующихся высокой плотностью бактериальных клеток, например, в ризосфере растений, где горизонтальная передача генов, включая передачу островов патогенности, происходит достаточно часто (Tyler H. L., et al., Triplett E. W., 2008). Обмен генетическим материалом между бактериями, ассоциированными с человеком и автохтонными обитателями природных объектов, может способствовать появлению новых эпидемических вариантов возбудителя, устойчивых во внешней среде и персистирующих на разных живых организмах. Изменение вирулентности патогенов во внешней среде может быть также результатом взаимодействия с другими живыми организмами, например, простейшими (Бухарин О.В., с соавт., Литвин В.Ю., 1997; Речкин А. с соавт., И., Евтеева Н. И., 2007; Berk S. G. et al., 2008; Saeed А. et al., 2012).

Вышеизложенное обусловливает возникновение явления полигостальности, характерной для ряда микроорганизмов (Бухарин О. В., Литвин В. Ю., 1997; Литвин В. Ю. с соавт., 1998). Полигостальность связывают с древним эволюционным происхождением процесса взаимодействия микро- и макроорганизмов, частным случаем которого является патогенез. Обычно оба хозяина принадлежат к одному биологическому царству. Гораздо реже встречаются случаи взаимодействия патогенного микроорганизма с представителями разных царств жизни, так называемые cross-kingdom host jumps (van Baarlen P. et al., 2007). К наиболее изученным представителям полигостальных патогенов относятся: Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Enterococcus faecalis, Salmonella enterica, Escherichia coli, причем с каждым годом в эту группу попадает все больше видов бактерий и грибов (Dong Y. M. et al., 2003, Tyler H. L., Triplett E. W., 2008).

Установлено, что некоторые виды условно-патогенных бактерий - Klebsiella pneumoniae (Iniguez A. L. et al., 2004), Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes (Zinniel D. K. et al., 2002), Serratia marcescens (Gyaneshwar P. et al., 2001), разные виды Pseudomonas (Rahme L. G. et al., 1997) обитают в растительных тканях. Исследованиями последних лет доказано присутствие в эндосфере растений бактерий, патогенных для человека – Listeria monocytogenes (Gorskiуе L. et al., 2003), Campylobacter jejuni (Brandl M. T. et al., 2004), S. enterica (Franz E. et al., 2007), E. coli (Wachtel M. R. et al., 2002; Bernstein N. et al., 2007).





Все это определяет высокую актуальность проблемы изучения сосуществования бактерий семейства Enterobacteriaceae с растениями, как в теоретическом, общебиологическом аспекте для изучения механизмов полигостальности и транспатогенеза, так и в прикладном медицинском, для определения роли растений в процессе циркуляции этих микроорганизмов во внешней среде.

Цель работы: обосновать механизмы полигостальности условно-патогенных энтеробактерий на основе изучения биологических свойств этих микроорганизмов и особенностей их взаимодействия с растениями.

ЗАДАЧИ:

  1. Определить влияние условий культивирования (среда, температура) на кинетику роста патогенных и условно-патогенных энтеробактерий (Sh. sonnei, Sh. flexneri, E. cloacae, E. aerogenes, C. freundii, K. pneumoniae, P. mirabilis).
  2. Выявить продукцию биологически-активных соединений, способствующих исследуемых видов энтеробактерий выживанию в тканях и органах растений.
  3. Оценить влияние условий культивирования на формирование биопленок исследуемыми видами патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.
  4. Провести сравнительный анализ воздействия условно-патогенных и патогенных энтеробактерий на рост и развитие растений.
  5. Определить скорость контаминации растительных тканей энтеробактериями.
  6. Изучить развитие ответных реакций растения на заражение энтеробактериями.
  7. Оценить контаминацию энтеробактериями растительных объектов (дикорастущие и культурные растения, в том числе, приобретенные в розничной продаже).

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые показано, что недостаток пищевых субстратов в среде культивирования способствует большей устойчивости патогенных и условно-патогенных энтеробактерий к условиям низких температур. Впервые у энтеробактерий, выделенных от больных людей, выявлены ферменты и биологически активные соединения, способствующие их персистенции в организме растения. Установлена зависимость формирования биопленки от условий культивирования.

Выявлено специфическое взаимодействие между условно-патогенными энтеробактериями и растениями, о чем свидетельствует их различное влияние на рост и развитие растений, зависимое от температуры. Впервые в модельной системе «растение картофеля in vitro - E. coli», показано, что полная колонизация растительных тканей энтеробактериями происходит на вторые-третьи сутки после инокуляции, при этом растение-хозяин распознает присутствие энтеробактерий в ризо- и эндосфере и отвечает активацией иммунного ответа уже в первые минуты после заражения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработан метод определения контаминации внутренних тканей овощей и фруктов патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, что позволяет оценить потенциальную опасность этих продуктов питания для здоровья человека.

Показано, что заражение растений условно-патогенными бактериями, как правило, не вызывает внешних симптомов повреждения растительного организма. Следовательно, контаминированные продукты питания растительного происхождения могут использоваться в качестве источников питания и способствовать последующему инфицированию человека.

Выявлено, что УПЭ, возбудители ОКИ человека, при попадании во внешнюю среду могут использовать растительные ткани как резервуар обитания, способствующий их сохранению вне организма человека.

ВНЕДРЕНИЯ

Материалы исследований использованы для подготовки методических рекомендаций для студентов ИГУ «Микробиологический мониторинг окружающей среды», утверждена научно-методическим советом ИГУ (2000 г.), врачей «Определение ферментативной активности условно-патогенных бактерий», уверждена Методическим советом ГБОУ ДПО ИГМАПО (2013 г.). Полученные результаты используются при проведении лекционных занятий на кафедре микробиологии ИГМУ, кафедре эпидемиологии и микробиологии ИГМАПО, кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ИГУ.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

  1. Недостаток питательных элементов способствует развитию устойчивости условно-патогенных и патогенных энтеробактерий человека к широкому диапазону температур (от 4 до 37 0С), что, в конечном итоге, обусловливает их выживаемость во внешней среде.
  2. Условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, обладают набором специфических экзоферментов и биологически-активных соединений, способствующих при попадании во внешнюю среду, созданию активных взаимоотношений с растительным организмом.
  3. В ответ на колонизацию энтеробактериями, условно-патогенными для человека, растение-хозяин отвечает активацией паттерн-индуцированного иммунитета (PTI) уже в первые минуты после инфицирования. Отсутствие специфических факторов патогенности, аналогичных таковым для фитопатогенов, приводит к тому, что контаминированное растение, как правило, не проявляет симптомов поражения и не способно быстро элиминировать из тканей эти микроорганизмы.
  4. Условно-патогенные энтеробактерии при попадании во внешнюю среду персистируют в растительных тканях, что позволяет считать растения одним из резервуаров, способствующих сохранению этих микроорганизмов во внешней среде.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты исследований были представлены: на Всероссийской научной конференции, "Стрессовые белки растений", Иркутск, 2004; Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2004; Региональной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания», Иркутск, 2006; семинаре врачей-эпидемиологов «Эпидемиология кишечных инфекций», Иркутск, 2006; Научно-практической конференции, посвященной 50-летию Иркутского НИИСХ «Роль сельскохозяйственной науки в развитии АПК Приангарья», Иркутск, 2007; Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, СИФИБР, 2007; Всероссийской молодежной научно-практической конференции «Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания», Иркутск, ИрГТУ, 2007; Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы Права, Экономики и Управления СИПЭУ», Иркутск, 2008; 2-м межрегиональном семинаре «Организация санитарно-эпидемиологического мониторинга за острыми кишечными инфекциями», Иркутск, 2008; II Всероссийской научно-практической конференции «Развитие физико-химической биологии и биотехнологии на современном этапе», Иркутск, 2008; Всероссийской научной конференции «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды», Иркутск, 2009; V Всероссийской конференции молодых ученых, Саратов, 2010; Международной научной конференции «Проблемы экологии: чтения памяти М. М. Кожова», Иркутск, 2010; VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений – фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий», Нижний Новгород, 2011; II Международной научно-практической конференции «Особенности формирования здорового образа жизни: факторы и условия», Улан-Удэ, 2012; научной конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии», посвященной 100-летнему юбилею ИЭМ ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, Иркутск, 2012.

ЛИЧНЫЙ ВКЛАД АВТОРА

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, подборе методов исследования и анализе полученных результатов. Все результаты, представленные в работе, получены при личном участии автора.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 52 работы, из них 16 в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций и 2 - монографии.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертационная работа изложена на 291 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 21 таблицу и 74 рисунка. Список литературы состоит из 377 источников, в том числе 304 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

    1. Объекты исследования

Микроорганизмы. В работе использовались: условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от людей, больных острыми кишечными инфекциями, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу – E. cloacae, E. aerogenes, K. pneumoniae, P. mirabilis, M. morganii, C. freundii; патогенные энтеробактерии Sh. sonnei и Sh. flexneri, выделенные от людей, больных дизентерией, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу ; E. coli штамм XL-1Blue (Fermentas, Латвия); фитопатогены - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus штамм 5369 (вирулентный, мукоидный), штамм CsR14 (вирулентный, мукоидный), полученные из НИИ картофельного хозяйства (пос. Коренево, Московская обл.) и Pectobacterium carotovorum штамм ВКМ В-1247, полученный из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино).

Растения. Картофель in vitro (Solanum tuberosum L.), сортов Луговской – устойчивый и Лукьяновский (Украинский НИИ картофельного хозяйства), восприимчивый к бактериальному фитопатогену C. michiganensis subsp. sepedonicus. Суспензионные культуры клеток картофеля (Solanum tuberosum L.) сорта Жуковский ранний и табака (Nicotiana tabacum). Семена растений салата (Lactuca sativa L.), сорт Крупнокочанный, сорт Кучерявец Одесский; редиса (Raphanus sativus), сорт Жара; капусты белокочанной (Brassica rapa), сорт Казачок Супер; гороха (Pisum sativum), сорт Аксайский усатый.

Объем проведенных исследований представлен в таблице 1.

    1. Материалы и методы

Для выделения бактерий из эндосферы проводили дезинфекцию поверхности растений с помощью 0,7 % раствора гипохлорита натрия. После этого растительный материал гомогенизировали и высевали в чашки Петри с МПА и со средой Эндо. Идентификацию бактерий проводили с использованием системы ММТЕ1 и ММТЕ2 (Multimicrotest systems for biochemical identification of Enterobacteriaceae).

Инокуляцию растений и суспензионных культур проводили в асептических условиях, делая смыв суточной культуры бактерий в 100 мл жидкой среды Мурасиге и Скуга (МS). Для инокуляции растений in vitro вносили 1,0 мл инокулята в каждую пробирку в конечной концентрации бактерий 1·108 КОЕ/мл. Для инокуляции табака на поверхность листовой пластины трехнедельных растений наносили каплю бактериальной суспензии. Инокулированные растения выращивали в факторостатных условиях при 16 часовом световом дне с контролируемым режимом выращивания при температуре 23-25 0С днем и при 18-20 0С ночью, влажностью 75-85 %, освещенностью 5000-7000 лк. При инокуляции суспензионных культур клеток растений 1,0 мл инокулята вносили в 24,0 мл суспензии.

Таблица 1.

Объекты и объем выполненных исследований


Направление исследований Объекты исследований Методы исследований Кол-во исследований
Выявление бактерий семейства Enterobacteriaceae в биотопах, выделяемых на растении Ризосфера, филлосфера и эндосфера дикорастущих и культурных растений - Клен ясенелистный (Acer negundo L.), Груша уссурийская (Pyrus pasha), Одуванчик лекарственный (Taraxacum officinalis), Подорожник большой (Plantago major), Чистотел большой (Chelidonium majus), Салат сорт Кучерявец Одесский, Томат сорт Сибирский скороспелый, Картофель сорта Луговской, Адретта, Огурец сорт Изящный Посев на микробиологические среды, идентификация выделенных культур с помощью биохимических тестов, определение антибиотикорезистентности диско-диффузионным методом, определение адгезивности 55 проб
Овощи и фрукты, приобретенные в розничной продаже (персик, слива, нектарин, черный виноград, томат, зеленый лук, зелень петрушки, перец болгарский, огурец, груша, яблоко, апельсин, банан) 256 проб
Сравнительный анализ спсобности условно-патогенных, патогенных и фитопатогенных видов энтеробактерий заселять эндосферу растений Патогенные и условно-патогенные виды семейства Enterobacteriaceae (E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii, P. mirabilis, M. morganii, K. рneumoniae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, P. carotovorum) Cемена растений – салат сортов Крупнокочанный и Кучерявец Одесский, капуста сорт Казачок Супер, редис сорт Жара, горох сорт Аксайский Усатый. Растения картофеля in vitro сорта Луговской, Лукьяновский Определение динамики ОП суспензии бактериальных клеток в зависимости от температуры и среды культивирования 184 измерения
Определение активности ферментов 132 измерения
Определение способности формировать биопленки 240 измерений
Определение способности синтезировать фитогормон ИУК 414 измерений
Влияние на рост и развитие растений 350 измерений


Таблица 1 (Окончание)

1 2 3 4
Определение колонизации растений энтеробактериями, патогенными для человека E.coli XL-1 Blue C. michiganensis ssp. sepedonicus СsR14 Растения картофеля in vitro сорта Луговской, Лукьяновский Определение КОЕ в разных частях иноколированного растения в динамике 150 посевов
Ответные реакции растений при взаимодействии с энтеробактериями, патогенными для человека E.coli XL-1 Blue P.carotovorum В-1247 C. michiganensis ssp. sepedonicus СsR14 Сравнение АФК продуцируемых суспензионной культурой клеток растений при заражении E. coli (XL1-Blue) и C. michiganensis ssp. sepedonicus (вирулентный штамм CsR14) 50 измерений
Определение АФК на поверхности корней растений картофеля (Solanum tuberosum) и редиса (Rhaphanus sativus L.) в ответ на E. coli (XL1-Blue), окраска DCF 30 измерений
Динамика внеклеточных АФК из корней редиса (R. sativus L.) сорта Жара в ответ на E. coli (XL1-Blue) и P. carotovorum (В-1247) 500 измерений
Динамика пероксидазной активности в растении редиса (R. sativus L.) сорта Жара при инокуляции E. coli (XL1-Blue) 50 измерений
Динамика пероксидазной активности в растении картофеля in vitro при инокуляции E. coli (XL1-Blue) и C. michiganensis ssp. sepedonicus (CsR14) 500 измерений




Определение колонизации растений in vitro бактериями проводили следующим образом. Инокулировали растения картофеля in vitro суспензией клеток E. coli и C. michiganensis. Ежедневно делали высев каждого растения на чашки Петри с МПА (Оболенск, Россия); для этого, с помощью стерильного пинцета вынимали растение из пробирки на стерильный коврик; разрезали растение на 4 зоны (зона корней, нижняя зона, средняя зона, верхушка). Все зоны растения выдерживались 10 мин в обеззараживающем растворе следующего состава: 0,7 % раствор гипохлорита натрия с добавлением 2 капель детергента Твин 80 («Ferak», Германия) и гомогенизировались. Для определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) проводили последовательное разведение инокулированной среды растения и полученного гомогената в стерильных эппендорфах.

Биотестирование проводили с помощью стандартных методов с некоторыми модификациями (Возняковская Ю. М., 1969).

Скорость размножения бактерий определяли в физиологическом растворе, забуференном 0.1 М фосфатным буфером с рН 7 (голодная среда) и среде Красильникова (полная среда). В колбу с 200,0 мл среды вносили 1,0 мл бактериальной суспензии по стандарту мутности. Бактерии культивировались на качалке при температуре 4, 24, 30 и 37 0С. Оптическую плотность измеряли на фотометре КФК-3 (Прибортех, Москва) при длине волны 540 нм через 1, 3, 5, 7, 24, 30, 48, 54, 72 часа.

Антибиотикорезистентность микроорганизмов определяли диско-диффузионным методом (НИЦФ, С-Петербург) (МУК 4.2.1890-04). Определение формирования биопленок бактериями проводили по методике И. А. Шагинян с соавт. (2007). Амилазную, протеолитическую, целлюлазную активности изучали общепринятыми методами (Нетрусов А. И., 2005). Целлюлазную активность выявляли – по фильтровальной бумаге, которую гидролизовали в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.9) при t 50о С. Количество редуцирующих сахаров оценивали по методу Шомоди-Нельсона (Синицын А. П. и др., 1990). Активность липазы определяли по оливковому маслу (Нетрусов А. И., 2005). Для определения количества белка использовали метод Лоури. Для изучения образования ауксинов в среду культивирования добавляли 200 мг/л триптофана. Бактериальную суспензию центрифугировали при 30000 g 10 мин. Дальнейшие исследования проводили с супернатантом. Количество ауксинов определяли по методу Сальковского (Чумаков М. И. и др., 1992).

Определение активности общей пероксидазы растений картофеля in vitro проводили по методу Бояркина (Бояркин А. Н., 1951) и выражали в условных единицах на мг белка. Активные формы кислорода оценивали спектрофотометрическим методом с использованием ксиленолового оранжевого (Bindschedler L.V. et al., 2001). Определение активных форм кислорода на поверхности корней, окрашенных флюоресцентнным красителем DСF, проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) с цифровой монохромной камерой Axio Cam MRm3 и пакетом программного обеспечения для захвата и анализа изображений «AxioVision Rel 4,6».

Статистическая обработка результатов. Эксперименты проводили в трех аналитических и трех биологических повторностях. Для статистической обработки результатов исследований использовали общепринятые параметрических и непараметрических критерии статистики (Рокицкий П. Ф., 1973; Гланц С, 1999; Савилов Е. Д. с соавт., 2011). Степень внутривидового разнообразия на уровне микробной популяции оценивали с помощью индекса разнообразия Симсона (Одум Ю., 1986), сходство между видовым составом двух объектов определяли, используя индекс сходства Серенсона (Одум Ю., 1986). В качестве коэффициента синхронности применяли коэффициент корреляции Спирмена (Савилов Е. Д. с соавт., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Адаптация условно-патогенных и патогенных энтеробактерий

к условиям внешней среды

При сапрофитном существовании патогенные и условно-патогенные бактерии подвергаются комплексному воздействию абиотических и биотических факторов среды обитания. В первую очередь, это более низкие температуры, а также недостаточное содержание питательных веществ. В случае, когда питательный элемент отсутствует, бактерии воспринимают новые условия как условия голодания. В процессе адаптации к таким условиям в клетках происходят изменения, затрагивающие их физиологию и морфологию, что приводит, в конечном счете, к мультирезистентности (Ермилова Е. В., 2007).

Для изучения адаптации к условиям внешней среды, УПЭ, изолированные от больных людей, помещали в условия, различающиеся доступностью питательных веществ и температурой. Использовались следующие виды – E. aerogenes, E. cloacae, C. freundii, P. mirabilis, M. morganii, K. pneumoniae. Для сравнения были взяты классические патогенные микроорганизмы, возбудители дизентерии – Sh. sonnei и Sh. flexneri.

Кривая роста каждого вида микроорганизма имела свою форму. При этом отмечено, что в условиях экстремально низкой температуры (4 0С) колебания плотности бактериальной популяции больше зависели от состава среды, чем при более благоприятных температурных условиях. Показано, что при этой температуре снижение количества клеток бактерий при культивировании в полной среде было более существенным, чем в голодной (рис. 1.).

1)

2)

Рис. 1. Динамика концентрации E. aerogenes (1) и K. pneumoniae (2) в забуференном физиологическом растворе (А) и в среде Красильникова (В)

Это свидетельствует о том, что доступность питательных веществ оказывает большее влияние на адаптацию микроорганизмов, чем температурные условия. Таким образом, в условиях внешней среды, где в отличие от организма человека и животных, наблюдается недостаток пищевых субстратов, бактерии лучше переносят действие неблагоприятных температур.

Можно предположить, что выявленная особенность является следствием, так называемого, « глобального стрессового ответа», когда клетка в условиях действия одного стрессора (в данном случае недостатка питательных веществ) приобретает устойчивость к действию другого стрессора (температуры) (Ермилова Е. В., 2006). Причем в этой ситуации влияние среды культивирования, вероятно, обусловливает устойчивость к низким температурам.

Интересно, что у многих изученных видов энтеробактерий, количество бактериальных клеток при всех условиях культивирования изменялось синхронно, отличаясь при этом лишь амплитудой колебаний. Степень синхронизации для разных видов была различной, однако при культивировании в полной среде при благоприятных температурах (24, 30 и 37 0С) она значима для всех исследованных видов (табл. 2, 3). Показано, что наибольшей степенью синхронности обладали патогенные микроорганизмы Sh. sonnei и Sh. flexneri (табл. 3).

Таблица 2

Коэффициент синхронности динамики популяции Klebsiella pneumoniae

Среда Температура, 0С Голодная Полная
Температура, 0С
4 24 30 37 4 24 30 37
Голодная 4 1,00 -0,30 0,47 -0,71* -0,55 -0,35 -0,54 -0,30
24 -0,30 1,00 -0,34 0,17 0,79* 0,19 0,45 0,50
30 0,47 -0,34 1,00 -0,16 -0,25 -0,01 -0,12 0,03
37 -0,71* 0,17 -0,16 1,00 0,38 0,21 0,38 0,22
Полная 4 -0,55 0,79* -0,25 0,38 1,00 0,45 0,63 0,56
24 -0,35 0,19 -0,01
0,21 0,45 1,00 0,92* 0,90*
30 -0,54 0,45 -0,12 0,38 0,63 0,92* 1,00 0,95*
37 -0,30 0,50 0,03 0,22 0,56 0,90* 0,95* 1,00

* р<0,05

Таблица 3

Коэффициент синхронности динамики популяции Shigella sonnei

Среда Температура, 0С Голодная Полная
Температура, 0С
4 24 30 37 4 24 30 37
Голодная 4 1,00 1,00* 0,99* 0,99* 0,71* 0,91* 0,71* 0,75*
24 1,00* 1,00 1,00* 1,00* 0,68* 0,88* 0,65* 0,70*
30 0,99* 1,00* 1,00 1,00* 0,68* 0,86* 0,61* 0,66*
37 0,99* 1,00* 1,00* 1,00 0,69* 0,88* 0,65* 0,70*
Полная 4 0,71* 0,68* 0,68* 0,69* 1,00 0,64* 0,68* 0,70*
24 0,91* 0,88* 0,86* 0,88* 0,64* 1,00 0,79* 0,81*
30 0,71* 0,65* 0,61* 0,65* 0,68* 0,79* 1,00 0,99*
37 0,75* 0,70* 0,66* 0,70* 0,70* 0,81* 0,99* 1,00

* р<0,05

Биологические свойства энтеробактерий, обусловливающие их способность выживать в организме растений

1) Образование биопленок

Необходимым компонентом процесса колонизации, как животных, так и растений, являются биопленки (Eberl L. et al., 2007). На поверхности листа биопленки формируются преимущественно вокруг устьиц и трихом, а также вдоль сосудов. Эти местообитания наиболее благоприятны по влажности и концентрации питательных веществ (Monier J. M., Lindow S. E., 2004). Патогены, например, фитопатогенная энтеробактерия Pantoea stewartii, вызывающая вилт кукурузы, формирует биопленки в инфицированных сосудах, синтезируя полисахарид стевартан и нарушая процессы транспорта (Koutsoudis M. D. et al., 2006). Cущественное влияние на степень формирования биопленок оказывают условия среды. Это в первую очередь наличие питательных элементов и доступность кислорода (Danhom T., et al., 2004; Monds R. D. et al., 2001; Okinaka Y.et al., 2002).

Способность образовывать биопленки была изучена у вышеуказанных видов энтеробактерий. Дополнительно использовали фитопатогенную энтеробактерию P. carotovotum ВКМ В-1247.

Сравнение оптической плотности биопленок, сформированных разными видами энтеробактерий, культивируемых в бульоне при 37 0С, как наиболее оптимальных условиях, показало, что наиболее высокую способность к пленкообразованию продемонстрировали виды – P. mirabilis, E. aerogenes, Sh. sonnei, Sh. flexneri и P. carotovorum (рис. 2).

Эти же виды, за исключением Sh. flexneri, формировали более плотные бипленки при культивировании в забуференном физиологическом растворе при той же температуре (см. рис. 2.). Таким образом, при 37 0С виды P. mirabilis, E. aerogenes и Sh. sonnei обладают большей пленкообразующей способностью независимо от среды культивирования.

На следующем этапе исследований изучали роль температурных условий в процессе формирования биопленочных сообществ. Оказалось, что при культивировании в бульоне, снижение температуры до 30 0С практически не влияло на способность энтеробактерий образовывать биопленки, за исключением E. cloacae и C. freundii. При этом, в забуференном физрастворе, у бактерий - E. cloacae, C. frendii, P. mirabilis, E. aerogenes, Sh. sonnei оптическая плотность биопленки при 30 0С была значимо ниже биопленок при 37 0С.

Рис. 2. Образование биопленок условно-патогенными и патогенными видами энтеробактериями при 37 0С: 1 –забуференный физиологический раствор; 2 – мясопептонный бульон

Сравнение биопленок, образованных при 24 0С и при 37 0С выявило значимые различия полученые для видов - P. mirabilis, K. pneumoniae, E. aerogenes, Sh. sonnei, Sh. flexneri, культивируемых в бульоне. При этом оптическая плотность биопленок при 24 0С была выше, чем при 37 0С. Эти же виды показали значимые различия при культивировании в физрастворе. Однако, плотность биопленки в этой среде была выше при культивировании при 37 0С. Температура 4 0С, является неблагоприятной для исследуемой группы микроорганизмов, поэтому в этих условиях большинство видов энтеробактерий, за исключением P. mirabilis, E. aerogenes и Sh. sonnei при культивировании в бульоне, не образовывали биопленку или ее оптическая плотность была незначительной. Таким образом, наиболее оптимальной температурой для формирования биопленок при культивировании энтеробактерий в бульоне является 24 0С. Тогда как бактерии культивируемые в забуференном физиологическом растворе образовывали биопленку с максимальной оптической плотностью при 37 0С (рис. 3). Следовательно, влияние температуры на степень формирования биопленки зависит от среды культивирования. При этом, бактерии характеризующиеся высокой пленкообразующей способностью при культивировании в бульоне при 37 0С, сохраняли эту способность в физиологическом растворе при той же температуре (рис. 3.).

а)

б)

Рис. 3. Оптическая плотность биопленки сформированной разными видами энтеробактерий, в зависимости от температуры культивирования (а – бульон; б – забуференный физиологический раствор): 1 - E. cloacae, 2 - E. aerogenes, 3 - C. freundii, 4 - P. mirabilis, 5 - K. pneumoniae, 6 - Sh. sonnei, 7 - Sh. flexneri, 8 - P. carotovotum.

2) Экзоферменты энтеробактерий, необходимые для выживания в растительных тканях

Для того, чтобы определить, могут ли энтеробактерии, этиологические агенты ОКИ, при попадании во внешнюю среду взаимодействовать с растениями, необходим набор особых экзоферментов, способствующий использованию растительных углеводных биополимеров в качестве питательных субстратов. Для решения представленной задачи были выбраны ферменты - марганец-пероксидаза, каталаза, липаза, уреаза, протеаза, целлюлаза, амилаза и пектиназа, которые определяли в супернатанте культуральной жидкости бактерий, находящихся в стационарной фазе роста (трое суток).

Основной компонент клеточной стенки растений – волокна целлюлозы. Целлюлозные микрофибриллы окружены пектинами, которые сильно гидратированы и образуют гель. Еще один компонент клеточной стенки – лигнин, ароматический полимер, обладающий высокой устойчивостью к биодеградации. Для того чтобы персистировать в организме растений, бактерии должны обладать ферментами, способными разлагать эти соединения. Марганец-пероксидаза, целлюлаза и ферменты пектиназного комплекса являются важными факторами патогенности фитопатогенных бактерий. У патогенных и условно-патогенных для человека энтеробактерий эти ферменты не изучались.

Марганец-пероксидазная активность, способствующая разрушению лигнина, обнаружена в среде культивирования бактерий E. cloacae, E. aerogenes, P. mirabilis, C. freundii. Максимальный показатель активности фермента (2,85 Ед/мг) зарегистрирован для E. cloacae, культивируемого в забуференном физиологическом растворе при 4 0С.

Целлюлазная активность супернатанта исследованных бактерий была слабая, однако микробиологический анализ с использованием карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) показал присутствие данного фермента, который по всей вероятности является индуцибельным (рис. 4). Особенно выраженной активностью целлюлазы обладали E. cloacae и C. freundii.

Ферменты пектиназного комплекса являются основными факторами вирулентности фитопатогенных энтеробактерий – представителей рода Pectobacterium. Другие представители Enterobacteriaceae, включая некоторые патогены человека, обладают сокращенными путями разложения пектина (Abbott D. W., Boraston A. B., 2008). Проведенные исследования выявили пектиназную активность супернатанта культуральной жидкости у бактерий видов E.cloacae, E.aerogenes, C.freundii, культивируемых в забуференном физрастворе (рис. 5.). Показано ее снижение при увеличении температуры культивирования.

1 2 3 4 5 6 7 8

Рис. 4. Целлюлазная активность используемых культур бактерий на среде с карбоксиметилцеллюлозой (1 – E. aerogenes, 2 – P. mirabilis, 3 – E. cloacae, 4 – C. freundii, 5 – P. carotovorum, 6 – Sh. flexneri, 7 – Sh. sonnei, 8 – K. pneumoniae).

Рис. 5. Активность пектиназы в среде культивирования бактерий

Защиту бактерий от действия активных форм кислорода (АФК), образующихся в результате активации иммунной системы растения, обеспечивает каталаза, которая нейтрализует свободные кислородные радикалы. Высокими значениями активности этого фермента характеризовались условно-патогенные виды, E. aerogenes (3.30 Ед/мг) и P. mirabilis (2.25 Ед/мг), тогда как для патогенных энтеробактерий, например, Sh. sonnei, она была относительно низкой (0,86).

Ферменты, обладающие липазной и протеазной активностью, являются неспециализированными факторами патогенности и существенны для колонизации хозяев разных таксономических групп. Высокой липазной активностью обладали E. cloacae и E. aerogenes - 2, 50 и 1,84 Ед/мг, соответственно. Протеазаная активность у исследованных видов практически не регистрировалась.

Запасающим веществом у растений служит крахмал, расщепление которого с помощью амилаз может обеспечить бактериальные клетки глюкозой. Проведенные эксперименты показали, что наибольшей амилолитической активностью обладали С. freundii (6,67 Ед/мг). Причем активность этого фермента возрастала в богатой среде культивирования при снижении температуры.

Определение амилолитической активности с помощью микробиологического анализа показало ее наличие у всех исследуемых видов (рис. 6.).

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 6. Амилолитическая активность исследуемых видов энтеробактерий на среде с крахмалом (1 – E. aerogenes, 2 – P. mirabilis, 3 – E.cloacae, 4 – C. freundii, 5 – Sh. flexneri, 6 – Sh. sonnei, 7 – K. pneumoniae).

Выживанию в почве и созданию ассоциаций с растениями способствует уреаза. Бактерии, продуцирующие уреазу, будучи широко распространены в природе, играют весьма важную роль, переводя накапливающуюся в почве мочевину, не усваиваемую растениями, в легко усваиваемый углекислый аммоний. Нами показано, что максимальной активностью внеклеточной уреазы характеризовались E. aerogenes, культивируемая в забуференном физрастворе (14,60 Ед/мг). Достаточно высокая активность фермента выявлена у E. cloacae (6,88 Ед/мг).

Все изложенное свидетельствует, что условно-патогенные и патогенные энтеробактерии, выделенные от людей с ОКИ, при попадании во внешнюю среду обладают спектром экзоферментов, обеспечивающих этим микроорганизмам проникновение в растения и их колонизацию.

3) Синтез индолилуксусной кислоты

Одним из метаболитов, способствующих взаимодействию бактерий с растительным организмом является бактериальная индолилуксусная кислота (ИУК). ИУК - одна из главных форм фитогормонов класса ауксинов. Показано, что этот фитогормон синтезируется как фитопатогенными, так и симбиотическими бактериями, так называемыми PGPR-штаммами (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) (Цавкелова Е. А. и др., 2006; Dimkpa C. O. et al., 2012). В то же время, имеются сведения о синтезе этого соединения свободноживущими микроорганизмами (Bianco C. et al., 2006).

Нами показано, что в забуференном физиологическом растворе при добавлении 200 мг/л триптофана и культивировании при 24 0С, наиболее высокие концентрации ИУК (333,82±18,7 мкг/мл) продуцировал E. aerogenes. Достаточно много этого фитогормона обнаружено в супернатанте C. freundii (140.91±12.23 мкг/мл) и P. mirabilis (184,12±12,65 мкг/мл) (рис. 7.).

Рис. 7. Концентрация ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования энтеробактерий разных видов

Даже в отсутствие триптофана, который, как известно, является предшественником бактериальной ИУК, в забуференном физиологическом растворе наблюдаются существенные концентрации ИУК в супернатанте E. aerogenes (148,23±5,02 мкг/мл) и P.mirabilis (138,86±2,32 мкг/мл). Внесение триптофана способствует возрастанию ее концентрации у E. aerogenes, C. freundii, P. mirabilis и Sh. sonnei (табл. 5).

Таким образом, виды E. aerogenes, C. freundii и P. mirabilis, изолированные от больных людей, являются активными продуцентами ИУК, что может обусловливать их действие на рост и развитие растений. Штамм K. pneumoniae при используемых условиях не образовывал данный метаболит.

Известно, что синтез метаболитов бактериями зависит от условий культивирования – в первую очередь, температуры и состава среды. Поэтому на следующем этапе исследований было изучено влияние температуры (4, 24 и 37 0С) на синтез ИУК в забуференном физиологическом растворе с 200 мг триптофана (рис. 8.). Определение зависимости концентрации синтезированной ИУК в зависимости от температурных условий проводили с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони (Гланц С., 1999). В результате попарного сравнения всех трех групп были получены следующие результаты. Для видов E. cloacae, P. mirabilis и P. carotovorum не выявлено значимого влияния температуры на синтез исследуемого метаболита. Остальные виды, за исключением Sh. flexneri, продемонстрировали увеличение синтеза ИУК при возрастании температуры культивирования. Причем для E.aerogenes значимый рост концентрации исследуемого соединения зафиксирован уже при 24 0С, тогда как для C. freundii и Sh. sonnei показано ее увеличение, только при 37 0С. Sh. flexneri, напротив продуцировала большие концентрации ИУК при 4 0С.

Таблица 5.

Концинтрация ИУК в среде культивирования разных видов энтеробактерий в зависимости от добавления триптофана (200 мг/л)

Вид микроорганизма Забуференный физиологический раствор без триптофана, 24 0С (мкг/мл) Забуференный физиологический раствор с триптофаном, 24 0С (мкг/мл)
E. aerogenes 148,23±5,02 333,82±18,70
E.cloacae 41,69±4,87 37,65±10,40
K.pneumoniae 0,0 0,0
C.freundii 68,51±6,22 140,91±12,23
P.mirabilis 138,86±2,32 184,12±12,65
S.sonnei 24,51±5,83 27,42±3,44
S.flexneri 34,83±26,07 78,83±7,57
P.carotovorum 17,34±5,40 20,40±2,48

Межклеточная жидкость растений, где обитают эндофитные микроорганизмы, богата сахарами, в связи с чем, было необходимо оценить влияние разных концентраций глюкозы на синтез исследуемого метаболита. Использовали забуференный физиологический раствор с 200 мг триптофана, обогащенный глюкозой (1 и 5 г/л) (рис. 9.).

Показано, что E. cloacae, Sh. flexneri и P. carotovorum синтезируют ИУК независимо от содержания глюкозы в среде. Для E. aerogenes, C. freundii и Sh. sonnei установлено, что внесение в среду культивирования 1 г глюкозы значимо снижает концентрацию синтезируемого фитогормона, в то время как при добавлении 5 г концентрация синтезированного метаболита не отличается от его содержания в забуференном физиологическом растворе без внесения сахара. Концентрация ИУК, синтезируемого P. mirabilis снижается при внесении сахаров в среду культивирования. Все изложенное свидетельствует, что концентрация ИУК в середе культивирования не увеличивается при ее обогащении глюкозой.

Рис. 8. Зависимость количества ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования разных видов энтеробактерий от температуры культивирования

Таким образом, энтеробактерии разных видов, выделенные от больных, способны синтезировать фитогормон ИУК, что свидетельствует о том, что при проникновении в организм растения они могут оказывать влияние на его жизнедеятельность. Из этих видов наиболее активными продуцентами были E. aerogenes, C. freundii и P. mirabilis, причем эти виды образовывали существенные концентрации метаболита даже в отсутствие триптофана. К. pneuminiae в данных условиях культивирования не образовывала ИУК. Оценка вклада температуры культивирования показала, что она либо увеличивала концентрацию синтезируемого продукта (E. aerogenes, C. freundii, Sh. sonnei) либо не оказывает влияния на его содержание в супернатанте (E. cloacae, P. mirabilis, P. carotovorum). Добавление в среду культивирования глюкозы не увеличивало концентрацию синтезированной ИУК, что свидетельствует, что этот метаболит формируется в голодной среде. Это можно объяснить тем, что экспрессия ключевого гена биосинтеза ИУК - ipdC происходит при недостатке углерода или при стрессовых условиях (Ona O. et al., 2005).

Рис. 9. Зависимость количества ИУК (мкг/мл) в супернатанте среды культивирования разных видов энтеробактерий от количества глюкозы

Изложенное выше свидетельствует, что патогенные и условно-патогенные для человека энтеробактерии, изолированные от больных людей, обладают биологическими свойствами благоприятными для колонизации растительных тканей. Следовательно, при попадании в организм растения, эти виды (в первую очередь E. aerogenes, C.freundii и P.mirabilis) могут оказывать существенное влияние на рост и развитие растительного организма, сопоставимое с таковым у эндофитных и разосферных бактерий.

Влияние энтеробактерий разных видов на рост и развитие растений

Классическим методом определения влияния бактерий на растения является метод биотестирования, позволяющий определить их фитотоксичность по всхожести семян и развитию проростков.

Оценку воздействия E.coli (штамм XL1-Blue) проводили, определяя влияние данного вида на всхожесть семян различных сельскохозяйственных растений: редис сорт Жара, капуста сорт Казачок Супер, горох Аксайский, салат крупнокочанный, салат сорт Кучерявец Одесский. Выбор растений был обусловлен тем, что они употребляются человеком в сыром виде и могут представлять потенциальную угрозу в качестве источника патогенов, вызывающих кишечные инфекции. Было выявлено, что при инокуляции семян, этот микроорганизм по-разному действует на различные виды растений, преимущественно ингибируя их прорастание и развитие.

Сравнительный анализ воздействия разных видов условно-патогенных и патогенных энтеробактерий на всхожесть и развитие растений был проведен с использованием семян редиса сорта Жара, который показал достаточную чувствительность к бактериям E. coli, в эксперименте, описанном выше. Взаимодействие происходило при температурах: 4 0С, 24 0С, 30 0С, 37 0С.

Оценка всхожести семян редиса, обработанных суспензией клеток разных видов бактерий, показала, что ни один из исследуемых видов не оказал такого подавляющего воздействия на всхожесть как фитопатоген P. carotovorum В-1247. Для этого вида наибольший процент подавления всхожести зарегистрирован при 24 0С, температуре, соответствующей условиям окружающей среды (табл. 6.).

Наиболее заметное влияние условно-патогенных и патогенных бактерий отмечено при 30 0С. В этих условиях, K. pneumoniae ингибировала всхожесть почти 30 % семян редиса.

Фитопатоген P. carotovorum В-1247 оказывал также наиболее ингибирующее воздействие на длину проростков и корешков редиса при всех температурах, кроме 4 0С. Это согласуется с данными литературы, согласно которым оптимум для данного фитопатогена располагается в диапазоне от 15 до 40 0C (Bhat K.A. et al., 2010)

Таблица 6.

Всхожесть семян редиса сорта Жара, обработанных разными видами энтеробактерий (n=30)

Вид Всхожесть при температуре (%)
30 0С 24 0С 4 0С
Enterobacter cloacae 90 ± 0,06 87 ± 0,06 90±0,05
Citrobacter freundii 97 ± 0,03 87 ± 0,06 77±0,08
Proteus mirabilis 83 ± 0,07 87 ± 0,06 77±0,08
Enterobacter aerogenes 77 ± 0,08 97 ± 0,03 77±0,08
Shigella sonnei 93 ± 0,05 93 ± 0,05 73±0,08
Shigella flexneri 83 ± 0,07 100 ± 0,00 73±0,08
Klebsiella pneumoniae 67 ± 0,09 100 ± 0,00 87±0,06
Pectobacterium carotovorum 70 ± 0,08 43 ± 0,09 90±0,05

Значимый ингибирующий эффект при 30 0С оказывали K. pneumoniae и E. aerogenes, а E. сloacae, напротив оказывала стимулирующее воздействие на длину проростка. При 24 0С значительное ингибирование длины проростка зафиксировано для C. freundii, K. pneumoniae, Sh. flexneri, корней - C. freundii, P. mirabilis, K. pneumoniae. При 4 0С у пятисуточных растений редиса были только корни, длину которых ингибировали виды - P. mirabilis и Sh. sonnei (рис. 10.).

Рис. 10. Длина проростка и корня редиса обработанного суспензией бактерий: 1 – температура 30 0С; 2 - температура 24 0С

Оценка зависимости ингибирующего влияния энтеробактерий от температуры с помощью дисперсионного анализа показала, что она значима для E. aerogenes и K. pneumoniae, а также при воздействии на корневую систему E. cloacae, Sh. sonnei и Sh. flexneri.

Сравнение внешних признаков заражения пятисуточных проростков редиса показало, что некоторые условно-патогенные и патогенные энтеробактерии обладают фитопатогенным действием, что проявляется в потемнении корешков и проростков (рис. 11).

Таким образом, наибольшее воздействие на растения редиса оказали K. pneumoniae, E. аerogenes. Влияние этих видов зависело от температуры, при которой происходило взаимодействие.

Оценку влияния некоторых УПЭ проводили также в гнотобиотических условиях на модели растений картофеля in vitro сортов Луговской и Лукьяновский. Использовали виды E. coli, штамм JM103, M. morganii, P. mirabilis, C. freundii и фитопатоген P. carotovorum var. atroseptica. Оценивали действие этих бактерий на прирост растений в длину. Оказалось, что влияние разных видов бактерий различается. Выраженное угнетение и последующая гибель зарегистрированы для растений, контаминированных фитопатогеном. Влияние E. coli, штамм JM103 проявлялось в виде стимулирующего действия на растения картофеля сорта Лукьяновский.

А. Б. В. Г.

Рис. 11. Внешний вид проросших семян редиса при заражении энтеробактериями. А. Контроль 30 0С; Б. заражение C. freundii, 30 0С; В. заражение Sh. flexneri, 30 0С; Г. Заражение P. carotovorum, 30 0С.

Заражение растения картофеля сорта Лукьяновский другими видами энтеробактерий, выделенными от больных людей (P. mirabilis, M. morganii, C. freundii) показало их преимущественно ингибирующее воздействие, зависимое от концентрации бактерий, при этом задержка роста уже в первые сутки контакта с патогеном свидетельствует о возможном включении защитных реакций растения. Следует отметить, что при внесении M. morganii в концентрации 1103 значимо стимулировало прирост растительного объекта.

Изучение скорости распространения и накопления

энтеробактерий в растении

Эксперименты, вошедшие в данный раздел исследования, посвящены определению кинетики колонизации растений энтеробактерией E. coli. Исследования выполнялись в гнотобиотической системе на растении картофеля in vitro. Использовали растения двух сортов – Луговского и Лукьяновского. Для сравнения скорости колонизации картофеля был использован фитопатоген C. michiganensis ssb. sepedonicus, так как ранее было установлено, что Луговской сорт обладает устойчивостью к фитопатогену, в то время как Лукьяновский сорт к нему восприимчив (Romanenko A. S. et al., 1999).

Показано, что C. michiganensis достигала верхней части растения восприимчивого сорта картофеля только через шесть суток после инокуляции, тогда как при заражении E. coli бактерии обнаруживались в этой же зоне уже в первые сутки. Одной из причин этого явления может быть высокая подвижность и быстрая скорость роста E. coli, в то время как C. michiganensis – неподвижный микроорганизм и, скорее всего, распространяется по растению с током воды.

Сравнение колонизации различных по специализации патогенов (условно-патогенная и фитопатогенная) выявило ряд особенностей в этом процессе. И в том, и в другом случае, восприимчивый сорт (Лукьяновский) быстрее колонизировался бактериями, что связано, вероятно, с отличиями в неспецифических защитных реакциях, замедляющих распространение бактерий независимо от их вида.

Изложенное выше свидетельствует об активном участии растения хозяина в регулировании заселения его тканей не только фитопатогенами, но и бактериями, условно-патогенными для человека.

Ответные реакции растений при взаимодействии с энтеробактериями,

патогенными и условно-патогенными для человека

Активация защитной системы растений индуцируется распознаванием присутствия чужеродного организма с помощью образ-распознающих рецепторов, т.н. паттерн-индуцированный ответ (PTI). Это узнавание запускает процессы последующего сигналлинга, включая активацию каскада МАР-киназ, потоки ионов и продукцию АФК, наблюдаемые в первые минуты после начала взаимодействия (O’Brien J. A. et al., 2012). При наличии у бактерий системы секреции третьего типа, способствующей поступлению эффекторных белков в цитозоль клетки-хозяина, развивается эффектор-индуцированный иммунитет (ETI). Он соответствует второй волне окислительного «взрыва» и наступает через три-пять часов после контакта с патогеном. В этом случае наблюдаются совместимые взаимодействия, приводящие к развитию болезни, либо несовместимые, заканчивающиеся реакцией сверхчувствительности (СЧ). Все изложенное касается взаимодействия растений с фитопатогенами, однако практически отсутствуют данные о реакции растений на бактерии, патогенные для человека.

В настоящем исследовании, культуры суспензионных клеток картофеля (Solanum tuberosum) сорта Жуковский Ранний и табака (Nicotiana tabacum), находящиеся в экспоненциальной фазе роста, инокулировали E.coli XL-1 Blue. Для сравнения использовали фитопатоген C. michiganensis ssp. sepedonicus (штамм СsR14), хозяином которого является картофель, а табак вступает в несовместимые взаимодействия с этой бактерией. Для определения АФК, использовали метод окрашивания перекиси водорода ксиленоловым оранжевым, поэтому под термином АФК подразумевается в первую очередь это соединение.

Продукцию АФК определяли в динамике начиная с первых минут взаимодействия. Оказалось, что в табаке первый пик окислительного «взрыва» индуцированного фитопатогеном и патогеном человека совпадал по амплитуде, тогда как в культуре клеток картофеля количество АФК в ответ на C. michiganensis было ниже.

Для того чтобы изучить развитие окислительного «взрыва» при несовместимых взаимодействиях, исследования были продолжены только на культуре суспензионных клеток табака. Оказалось, что в ответ на C. michiganensis наблюдается второй подъем уровня АФК, что соответствует данным литературы, согласно которым табак отвечает на заражение этим фитопатогеном реакцией СЧ. В ответ на патоген человека также развивалась вторая волна окислительного взрыва, хоть и меньшая по амплитуде. Это свидетельствует, что развитие ответа на данный микроорганизм суспензией табака ближе к несовместимому варианту взаимодействия бактерий с растениями.

Сравнение развития ответных реакций в корневой системе растений разных видов: семисуточные проростки редиса (Rhaphanus sativus L.) и растения картофеля (Solanum tuberosum) in vitro показало, что продукция АФК при воздействии E. coli XL-1 Blue имела сходную динамику. В исследуемых растениях увеличение уровня АФК наблюдалось уже через пять минут после взаимодействия. Второй подъем концентрации этих сигнальных частиц зарегистрирован через 180 минут. Таким образом, как растения картофеля in vitro, так и семисуточные проростки редиса отвечают на заражение условно-патогенной E. coli сходным образом.

Основным регионом, где происходит взаимодействие между ризосферными микроорганизмами и растением является среда, непосредственно окружающая корни. Здесь скапливается большое количество метаболитов, в том числе активных форм кислорода.

Измерение концентрации перекиси водорода проводили в течение 28 часов в стерильной дистиллированной воде, помещая туда корни редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара и инокулируя E. coli XL-1 Blue. Для сравнения использовали фитопатогенную энтеробактерию P. carotovorum B-1247 (рис. 12, 13).

Рис. 12. Концентрация АФК в среде при кокультивировании корней редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара и E. coli XL1-Blue

Рис. 13. Концентрация АФК в среде при кокультивировании корней редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара и P. carotovorum В-1247

Первая фаза окислительного «взрыва», приходящаяся на первые минуты взаимодействия, соответствует, вероятно, развитию PTI. При этом ответ на E. coli был более протяженным по времени (60 мин). Вторая волна окислительного «взрыва» была сильнее выражена при взаимодействии с условно-патогенной бактерией, тогда как концентрация АФК, индуцируемое P. carotovorum на протяжении последующих пяти часов было практически неизменным. Вероятно, фитопатоген блокирует развитие защитных реакций растения с помощью эффекторных молекул, поставляемых посредством системы секреции третьего типа (Galan J. E., Wolf-Watz H., 2006).

Через 24 – 28 часов, напротив, флуктуации концентраций этих сигнальных частиц, образующихся в ответ на инокуляцию E. coli XL1-Blue, постепенно затухали с тенденцией к снижению содержания этой молекулы в среде. Тогда как амплитуда колебаний концентрации этой сигнальной молекулы в ответ на фитопатоген увеличивалась. Можно предположить, что в этот момент времени начинается поражение растительных тканей пектолитическими ферментами микроорганизма и, следовательно, развитие заболевания.

Значительную роль в генерировании перекиси водорода в процессе защитного ответа и в резистентности к широкому кругу патогенов играют пероксидазы (Daudi А. et al., 2012), которые вносят большой вклад в первую фазу окислительного «взрыва» (O’Brien J. A. et al., 2012). Учитывая это положение было проведено определение активности этого важного стрессового фермента на ранних стадиях взаимодействия растений с бактерией, патогенной для человека. Активность пероксидазы измеряли в корнях, стеблях и листьях семисуточных проростков редиса и картофеля in vitro сортов Луговской и Лукьяновский. Для сравнения использовали фитопатоген C. michiganensis ssp. sepedonicus.

Инокуляция патогеном человека приводила к значительному изменению активности пероксидазы в первые минуты эксперимента. Однако, через час взаимодействия активность фермента возвращалась на уровень контроля и оставалась на этом уровне до пяти часов (время эксперимента) (рис. 14).

Рис. 14. Активность растворимой пероксидазы в разных частях проростков растений редиса (Rhaphanus sativus L.) сорта Жара после взаимодействия с E. coli XL1-Blue

Активность пероксидазы в ответ на фитопатоген в первый час кокультивирования имела динамику, сходную с таковой на патоген человека, в то время как в последующие часы в разных частях растения картофеля и в разных сортах она имела отличия. С различной активностью пероксидазы, вероятно, связана и большая восприимчивость Лукьяновского сорта картофеля к возбудителю кольцевой гнили. Изменения активности пероксидазы в верхней части стебля картофеля могут быть показателями системного ответа растения как на фитопатоген, так и на патоген человека.

Через десять суток кокультивирования результаты активности пероксидазы продемонстрировали, что у растений, кокультивируемых с E. coli активность фермента в корнях и верхушке возвращалась на уровень контроля. В средней же части растений исследуемый показатель был значительно выше. При заражении C. michiganensis, напротив, активность исследуемого фермента в верхней части растения была значимо выше контрольной. При этом существенных отличий между сортами зафиксировано не было.

Таким образом, на ранних стадиях взаимодействия (в первые пять часов) динамика активности пероксидазы, большей частью зависит от сортовых особенностей растения. Тогда как через десять суток кокультивирования на ее уровень влияет вид микроорганизма. Это может быть связано с тем, что динамика активности пероксидазы в первые часы после заражения отражает развитие неспецифического PTI, а на поздних стадиях инокуляция растений микроорганизмами приводит к специфическим отношениям: хозяин-паразит или хозяин – ассоциативный микроорганизм и т.д.

Одним из наиболее часто используемых тестов на активацию эффектор-индуцированного иммунитета является тест на развитие реакции сверхчувствительности с помощью нанесения микробной взвеси на поверхности листа растения, с которым этот микроорганизм вступает в несовместимые взаимоотношения (Spoel S. H., Dong X., 2012).

Известно, что система секреции третьего типа у патогенов животных и растений имеет существенные отличия, поэтому, вероятно, возбудители болезней человека не способны поставлять эффекторные белки в цитозоль клетки-хозяина (Galan J. E., Wolf-Watz H., 2006). Существуют единичные работы, посвященные этому вопросу, в которых предоставляются косвенные доказательства участия эффекторных белков Salmonella в регуляции иммунного ответа растений (Schikora A. et al., 2011).

Нами не зарегистрировано развитие реакции сверхчувствительности (СЧ) при нанесении большинства бактерий на поверхность листа растения табака. Только для C. freundii и K. pneumoniae были выявлены некротические поражения, по форме напоминающие СЧ.

Полученные данные свидетельствуют, что исследуемая группа энтеробактерий не оказывает выраженного патологического влияния на организм растения, за исключением K. pneumoniae, которая показала ингибирующее воздействие на всхожесть и развитие проростков семян редиса и привела к поражению листовой пластинки табака (Nicotiana tabacum). Действие большинства патогенов человека, вероятно, аналогично действию нефитопатогенных эндофитов, которые распознаются растением, но сосуществуют с ним в мутуалистической манере. Тем не менее, эти бактерии, возможно, способны блокировать ряд ответных реакций растения, связанных с развитием паттерн-индуцированного иммунитета или эффектор-индуцированного иммунитета. Именно с этим может быть связана способность УПЭ быстро распространяться по растению и вести эндофитный образ жизни.

Выделение патогенных для человека бактерий

из ризо-, филло- и эндосферы растительных тканей

В настоящем разделе представлены исследования, посвященные определению контаминации разных видов растений представителями семейства Enterobacteriaceae. Соотношение почвенных, ризосферных и эндосферных микроорганизмов, выросших на различных средах показало, что количество микроорганизмов в ризосфере на порядок больше, чем в почве (8107 и 2106). При этом, в почве количество КОЕ, выросших на среде Эндо, значимо ниже КОЕ на других средах, в то время как в ризосфере эти количества были сопоставимы. В эндосфере количество КОЕ, выросших на всех средах было значимо ниже, чем в ризосфере и почве, что свидетельствует об относительно низкой заселенности растительных тканей микроорганизмами (рис. 15.).

Рис. 15. Логарифм количества КОЕ почвенных, ризосферных и эндосферных бактерий в растении салата сорт Кучерявец Одесский: - почва; - ризосфера; - эндосфера

Сравнение соотношения морфологических типов бактерий показало, что как в ткани, так и в смывах представлены большей частью грамотрицательные палочки (52,3 % в тканях и 54,9 % в смывах), грамотрицательные кокки чаще встречались в смывах (8,1 % и 14,8 % соответственно) (рис. 16.). Количество грамположительных палочек в мякоти растений было более чем в два раза больше чем в смывах (25,6 и 11,3 %, соответственно), тогда как количество грамположительных кокков практически не различалось (13,9 и 19,0 %). Сравнение контаминации исследованных объектов бактериями различных типов с помощью критерия Боярского показал, что значимые различия выявлены только в содержании грамположительных палочек.

Рис. 16. Соотношение морфологических форм в мякоти (А) и смывах (В) исследованных овощей и фруктов: - грамположительные палочки; - грамотрицательные палочки; - грамположительные кокки; - грамотрицательные кокки

Представители семейства Enterobacteriaceae значительно чаще встречались в почве (75,00 % проб) и в смывах (76,86 %), чем в тканях растений (50,90 %).

Всего было выделено 179 культур микроорганизмов, относящихся к семейству Enterobacteriaceae. Из них 69 были изолированы из почвы, 46 из смывов и 64 из растительных тканей.

Родовой состав условно-патогенных микроорганизмов в зависимости от исследуемого объекта (ризосферная почва, смыв с поверхности, ткань растения) представлен на рис. 17.

Рис. 17. Спектр видов энтеробактерий, выделенных из ризосферной почвы, смывов с поверхности и ткани обработанной дезинфектантом: 1 – Providentia; 2 – Enterobacter; 3 – Serratia; 4 - Citrobacter; 5 - Salmonella; 6 - Morganella; 7 - Escherichia; 8 - Proteus; 9 - Klebsiella; 10 - Hafnia; 11 - Erwinia

Полученные результаты свидетельствуют, что видовой спектр энтеробактерий в исследованных объектах достаточно богат. Индекс разнообразия Симпсона показал, что наибольшим разнообразием характеризовалась филлосфера (0,90), тогда как в эндосфере и ризосфере он составлял 0,84 и 0,66 соответственно. Таким образом, несмотря на большое количество изолятов из ризосферы видов относящихся к семейству Enterobacteriaceae, зарегистрировано меньше, чем в других биотопах растения. Это объясняется тем, что в пробах ризосферной почвы наиболее часто встречался вид Providentia stuarti, который составлял 55,07 % от всех выделенных культур, о чем свидетельствует индекс доминирования Симпсонаравный 0,34. В эндосфере индекс доминирования был равен 0,16. В этом биотопе в 34,38 % выделялся Enterobacter aerogenes. Наиболее низкий показатель доминирования отмечен для смывов (филлосферы) - 0,10.

Для оценки потенциальной опасности выделенных культур для человека, было использовано определение степени адгезии бактериальных клеток к эритроцитам человека.

Фактор адгезии определяли у 43 культур, выделенных из дикорастущих и съедобных растений. Из них неадгезивных культур (меньше 1,75) не было, слабоадгезивных (1,76-2,5) - одна, среднеадгезивные (2,51 - 4) - девять, высокоадгезивные (выше 4,1) - 33.

Таким образом, большая часть энтеробактерий выделенных из смывов, почвы и внутренних тканей растений обладала высокой степенью адгезии, что может свидетельствовать об их потенциальной вирулентности. Сравнение уровня адгезивности в зависимости от объектов выделения не показало значительных различий. Так, среди культур выделенных из ткани растений 66,7 % обладали высокой адгезивностью, из почвы 75,0 %.

Другим фактором, позволяющим установить эпидемическую значимость выделенных культур является их отношение к антибиотикам. Известно, что патогенные для человека и животных микроорганизмы могут приобретать устойчивость к антибиотикам, применяемым в клинической практике и ветеринарии. Поэтому c помощью диско-диффузионного метода было проведено определение антибиотикочувствительности выделенных культур к 22 антибиотикам (табл. 7.).

Все выделенные культуры были чувствительность по отношению к амикацину, офлоксацину, тобрамицину, цефтазидину и цефтриаксону. Высокая чувствительность зарегистрирована для карбенициллина, цефотоксима, ципрофлоксацина, гентамицина. Больше половины штаммов (56 – 77 %) были чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, канамицину, фурадонину, цнфуроксиму, левомицетину, рифампицину. 89 % всех культур были устойчивы к оксациклину.

Таблица 7.

Отношение к антибиотикам культур энтеробактерий, выделенных и ризо-, филло- и эндосферы растений

Антибиотик Чувствительные культуры (%) Устойчивые культуры (%)
Амикацин 100,00 0,00
Норфлоксацин 100,00 0,00
Тобрамицин 100,00 0,00
Цефтазидин 100,00 0,00
Цефтриаксон 100,00 0,00
Карбенициллин 93,33 6,67
Цефотоксим 93,33 6,67
Ципрофлоксацин 93,33 6,67
Гентамицин 88,64 11,36
Стрептомицин 77,36 22,64
Тетрациклин 75,47 24,53
Канамицин 73,58 26,42
Фурадонин 73,33 26,67
Цефуроксим 73,33 26,67
Левомицетин 66,04 33,96
Рифампицин 56,60 43,40
Ампицилин 49,06 50,94
Цефазолин 46,67 53,33
Цефалексин 46,67 53,33
Полимиксин 43,40 56,60
Цефалотин 40,48 59,52
Оксациллин 11,36 88,64


Pages:   || 2 |
 


Похожие работы:

«МИНВАЛЕЕВ Ринад Султанович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ВНУТРИОРГАННОГО КРОВОТОКА ПРИ ИЗБРАННЫХ ПОЗАХ ЧЕЛОВЕКА (ПО ДАННЫМ ДОППЛЕРЭХОГРАФИИ) 03.00.13 - физиология человека и животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 1999...»

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУН ГНЦ ПМБ ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный...»

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ МАРТ авторефераты 1. Александрова, Наталья Владимировна. Состояние системы мать-плацента-плод, течение и исходы беременности, наступившей с использованием вспомогательных репродуктивных технологий : автореферат диссертации. доктора медицинских наук : 14.01.01 / Н. В. Александрова ; конс.: О. Р. Баев, Г. Т. Сухих ; Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова (М.). - М. : б. и., 2013. - 46 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1).

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«Суфияров Ринат Сабитович КОМПЛЕКСНАЯ ПРОФИЛАКТИКА, ДИАГНОСТИКА И ХИРУРГИЧЕСКОЕ ЛЕЧЕНИЕ АССОЦИИРОВАННЫХ ГНОЙНО- ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ 14.01.17. – ХИРУРГИЯ 03.02.03- микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук УФА – 2011 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ Авторефераты Январь-2013 1. Аббасова, Самира Фуад кызы. Возможности видеоэндоскопического хирургического лечения хронического калькулезного холецистита у лиц пожилого возраста : автореферат диссертации. кандидата медицинских наук : 14.01.17 / С. Ф. Аббасова ; Российский университет дружбы народов (М.), кафедра госпитальной хирургии. - М. : б. и., 2013. - 19 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1). 2.

«ШАРПАН Мария Владимировна МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ МОРЯ 03.00.16 – Экология (физико-математические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук К раснодар 200 8 Работа выполнена на кафедре прикладной математики ГОУ ВПО К убанский государственный...»

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«Шрамко Павел Александрович РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ОБОЛЕНСК-2012 Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки Государственный...»






 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.