WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


Регуляция каталитической активности алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами пирацетам, зорекс и унитиол

На правах рукописи

Золотарева Наталья Владимировна

Регуляция каталитической активности

алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами

Пирацетам, Зорекс и Унитиол

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Тверь – 2011

Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Лапина Галина Петровна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна кандидат биологических наук, доцент Карцова Софья Владимировна
Ведущая организация Самарский государственный медицинский университет

Защита диссертации состоится « 12 » мая 2011 года в 14 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70/1Б, корп. 5, ауд. 318. 

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170100, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.

Автореферат разослан «___» апреля 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета Н. В. Костюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма – регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю.М., Сатановская В.И., Садовник М.Н., 1969; White, A.M., 1998; Нужный В.П., 2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека (Бурков Ю.В., Иванова Н.Н., 2008), а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.

Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды (Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) (Xie P., 2005), растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т.В., 2001) и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Сапожников Г.П., Лозитнова А.Б., 2004; Лапина Г.П., Золотарева Н.В., 2006 – 2008).

Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами c точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 2002). До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю.В., Ведерникова Н.Н., 1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).

Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A.I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е.Ю., 2003; Zidoni Е., Кrеter M., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.

В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс (Wyllie M. G., Paciorec P. M., 2001; Waterfall J. F., 2003). Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает функции головного мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G., Pastoris O., 1997); Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993; Roglev M., 2001).





Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.

Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro.

Задачи исследования:

  1. Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.
  2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его:

- рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;

- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;

- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.

  1. Установить тип регулирования (активации или ингибирования) алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.
  2. Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Kм' V' – системе координат и на этой основе рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину -, -, - векторов).

Научная новизна результатов исследования

Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению влияния фармакологических препаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол на каталитическую активность АДГ.

Впервые выявлены типы активации АДГ при действии на фермент фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола и установлена эффективность функционирования биокатализатора на основе векторных построений данных ферментативной кинетики в трехмерной Kм'V' – системе координат, позволивших впервые получить визуализацию хода ферментативного процесса с участием АДГ в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола и рассчитать новый ферментативный параметр – длину вектора, характеризующего интенсивность активации фермента и отражающего суммарную эффективность функционирования биокатализатора.

Теоретическая и практическая значимость работы. Работа носит фундаментальный характер и направлена на изучение молекулярно-кинетического поведения алкогольдегидрогеназы.

Полученные данные в рамках разработанного в данной работе многоэтапного научно-методического подхода расширяют и развивают теоретические представления об эффективности регулирования биокатализа в присутствии различных добавок.

Разработанная схема изучения типа регулирования (активации или ингибирования) АДГ для фармакологических препаратов (Пирацетам, Зорекс и Унитиол), направленная на поиск оптимальных условий течения ферментативной реакции, может служить моделью для изучения других фармпрепаратов, действующих на фермент утилизации этанола – алкогольдегидрогеназу – с целью устранения последствий интоксикации организма.

Часть полученных данных и сделанные выводы использованы при выполнении проекта № 2.1.1/1897 «Исследование взаимосвязи структурно-динамических свойств ферментов с их функциональной активностью и разработка новых биокатализаторов на основе иммобилизованных окислительно-восстановительных ферментов для биомедицинской и пищевой промышленности», выполняемого по аналитической ведомственной целевой программе «Развитие научного потенциала высшей школы (2009-2011 годы)». (Заказчик проекта – Министерство образования и науки Российской федерации, Федеральное агентство по образованию).

Научные результаты, выносимые на защиту:

1. Максимальная субстратная специфичность выделенной и очищенной из пекарских дрожжей алкогольдегидрогеназы среди спиртов различного строения наблюдается к этиловому спирту. Рассчитаны значения важнейших ферментативных параметров биокатализатора (Кm, Vmax и Kкат). Выявлена оптимальная концентрация специфичного субстрата – этанола, равная 1,5·10-2М.

2. Разработанный многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы позволил установить, что фармпрепарат Пирацетам как активатор алкогольдегидрогеназы обладает большей эффективностью в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

3. Пирацетам, Зорекс и Унитиол по-разному активируют алкогольдегидрогеназу, а именно в случае Пирацетама – двухпараметрически рассогласованный тип активации (IIa-тип, Крупянко В.И., 1994), для Зорекса и Унитиола – двухпараметрически согласованный тип активации (Ia-тип, Крупянко В.И., 1994) фермента.

4. Расчет дополнительного ферментативного параметра – значения длины вектора – на основе векторного построения геометрического «портрета» алкогольдегидрогеназной реакции подтвердил наибольшую эффективность фармпрепарата Пирацетама в сравнении с Зорексом и Унитиолом.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Полученные результаты соответствуют пункту 4 паспорта специальности 03.01.04 «Биохимия (биологические науки)».

Апробация и реализация результатов диссертации

Основные положения и выводы диссертации апробированы в выступлениях на научных конференциях. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на V и VII научных конференциях аспирантов и студентов химического факультета (Тверской государственный университет, Тверь, 2006 и 2008); на XVI и XVII Региональных Каргинских чтениях «Физика, химия и новые технологии» (Тверской государственный университет, Тверь, 2009 и 2010); на Международной конференции «Состояние воды в биологических и модельных системах» (Тверская государственная медицинская академия, Тверь, 2007); Всероссийской научной школе для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных органических соединений» (Тверская государственная сельскохозяйственная академия, Тверь, 2010), а также на научных семинарах кафедры физико-химической экспертизы биоорганических соединений ТвГУ и при выполнении дипломных работ, в которых соискатель был научным руководителем дипломников.

Полученные результаты по выявлению особенностей ферментативного поведения алкогольдегидрогеназы печени лошади и оптимизации метода выделения фермента из пекарских дрожжей используются в исследовательской работе и в учебном процессе на кафедре физико-химической экспертизы биоорганической экспертизы ТвГУ: в курсе лекций, при подготовке курсовых и дипломных работ студентов.

Публикации. Результаты исследования отражены в 9 публикациях, 3 из которых в рецензируемых научных журналах, включенных в перечень ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 70 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 68 рисунками.





ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

– Алкогольдегидрогеназа печени лошади – очищенный гомогенный коммерческий препарат фирмы «Reanal» (Венгрия).

– Алкогольдегидрогеназа пекарских дрожжей (выделен по методу Г.А. Кочетова).

– Фармакологический коммерческий препарат Пирацетам (2-оксо-1-пирролидинилацетамид) фирмы ОАО «Фармстандарт – УфаВита» (Россия) (в ампулах).

– Фармакологические коммерческие препараты Зорекс (Унитиол–2,3-димеркаптопропансульфонат натрия и кальция пантотената) (в капсулах) и Унитиол – фармпрепараты фирмы «Valenta» (Россия) (в ампулах).

– Сывороточный альбумин человека (САЧ) коммерческий препарат, лиофилизованный из человеческой сыворотки, фирмы «Reanal» (Венгрия).

В работе использованы следующие методы:

Метод выделения и очистки АДГ (метод Г.А. Кочетова, 1998) с некоторыми собственными изменениями методики (с использованием буферных растворов рН 6,0 и 7,5; тепловой обработки при 35C). Схема выделения и очистки АДГ дана на рис.1. Выделение фермента АДГ из пекарских дрожжей вели в течение трех недель.

Рис.1. Схема выделения и очистки АДГ из пекарских дрожжей по методу Г.А. Кочетова с собственными модификациями

Метод калибровочного графика, построенного по белку-стандарту – коммерческому препарату сывороточный альбумин человека (рис.2), применяли для оценки и расчета концентрации ферментативно-активного белка.

Метод определения ферментативной кинетической активности АДГ. При окислении этилового спирта образуется восстановленный НАД, количество которого определяли фотометрически.

АДГ

С2Н5ОН+НАД + СН3СНО + НАД·Н + Н+

Измеряли увеличение значения оптической плотности (D) при длине волны 340 нм во времени (t). Контрольная кювета не содержала субстрата. Активность рассчитывали исходя из данных, полученных в течение 15—45 с хода ферментативной реакции.

Метод ЛайнуивераБерка для обработки данных ферментативной кинетики и расчета важнейших ферментативных параметров: Km константы Михаэлиса, Vmax максимальной скорости реакции и Kкат константы каталитической. В ходе ферментативной реакции рассчитывали начальные скорости реакций по зависимостям оптической плотности (D) во времени (t), строили прямые в координатах Лайнуивера–Берка (1/V и 1/[S]) и вели расчет важнейших ферментативных параметров – Кm, Vmax и Kкат.

Метод векторных диаграммных построений. В трехмерной Kм'V'-системе прямоугольных координат каждая ингибируемая или активируемая ферментативная реакция получает свое векторное представление конкретный трехмерный вектор L этой реакции. При этом длина данного вектора характеризует интенсивность протекания ферментативной реакции: положение L вектора в системе координат – тип изучаемой реакции, направление смещения – тенденцию к смене типа реакции, а траектория, описываемая подвижным концом вектора, – геометрический «портрет» изучаемой реакции.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изученные ферментативные системы:

Ферментативная система-1 (система контроля): АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД различных концентраций (5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 2,5; 1,5)(10-2М).

Ферментативная система-2 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)(10-2М).

Ферментативная система-3, включающая фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)(10-2М).

Ферментативная система-4 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5·10-2М) при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0)(10-2М).

Ферментативная система-5: фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5·10-2М) (как составная часть Зорекса) при варьировании концентраций НАД (1,5–5,0)(10-2М).

Первый этап работы, изложенный в пункте 4.1 диссертации, посвящен выделению и очистке АДГ из пекарских дрожжей (рис. 1) по методу Г.А. Кочетова с собственными изменениями. Изучена субстратная специфичность АДГ в группе различных субстратов (этиловый, бутиловый и изопропиловый спирты). Определены важнейшие ферментативные параметры – Кm, Vmax и Kкат, найдена оптимальная концентрация этанола.

По калибровочной зависимости (рис. 2) рассчитали содержание ферментативно активного белка в полученных экстрактах. Для значения величины оптической плотности (D), равной 0,50 опт. ед., по калибровочной кривой нашли значение концентрации фермента, составившее 8,42·10-5 г белка /г сырой массы дрожжей или 2,41·10-4М.

Рис. 2. Калибровочная зависимость оптической плотности (D) от концентрации белка (С)

сывороточного альбумина человека («Reanal», Венгрия)

Для изучения субстратной специфичности использовали водные растворы различных субстратов: этанола, изопропанола и бутанола-1, концентрации которых меняли в интервале (1,5–6,0)·10-2М. Далее определяли кинетику течения биокаталитической реакции по изменению величины оптической плотности (D) во времени (t). В качестве примера на рис. 3 представлены зависимости D~t для водного раствора субстрата этанола концентраций и (·10-2М) 6,0 и 1,5.

Рис. 3. 3асимости оптической плотности (D) во времени (t) окисления субстрата-этанола водным раствором АДГ (2,41·10-4М) печени лошади для концентраций (·10-2М) субстрата: a 6,0 и b 1,5

На основе кинетических зависимостей (рис. 3) рассчитывали начальные скорости АДГ-зависимых ферментативных реакций (V0), которые спрямляли в координатах двойных обратных величин (координатах Лайнуивера–Берка) (рис. 4).

Рис. 4. Зависимость обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстратов этанола (·) и НАД – () для водного раствора АДГ дрожжевой (2,41·10-4М)

На основе рис. 4 провели расчет значений Km, Ккат и Vmax для водного раствора фермента (2,41·10-4М), которые составили, соответственно, (2,85 ± 0,19)·10-5М; (9,23 ± 0,18)·10-2с-1 и (3,86 ± 0,18)·10-5опт.ед./с. Полученные характеристики корректно согласуются с данными литературы (Xie P., Parsons S.H., Speckhard D.C., 1997), что указывает на достоверность полученных данных.

По вышеприведенной схеме определены ферментативные параметры для двух других субстратов: бутанола-1 и изопропанола (табл.1). В ряду субстратов-спиртов (этанол, бутанол-1 и изопропанол) численные значения Km возрастают в 3,2 раза и уменьшаются в 1,6 раза значения Vmax. Это означает, что в изученной группе субстратов АДГ: этанол – бутанол-1 – изопропанол, – сродство их к ферменту постепенно снижается. Для этанола найдена максимальная активность АДГ дрожжевой (Vmаx), минимальная – для изопропанола.

Таблица 1

Рассчитанные параметры ферментативной активности АДГ дрожжевой для водных растворов различных спиртов субстратов

Субстрат Кm,·10-5 М Vmax,·10-5 опт.ед./с Ккат,·10-2 с-1
Этиловый спирт 2,85±0,19 3,86±0,18 9,23±0,18
Бутиловый спирт 6,67±0,21 2,47±0,21 6,19±0,21
Изопропиловый спирт 9,09±0,20 1,49±0,20 3,47±0,20

Активность (Ккат) по бутанолу-1 и изопропанолу уменьшается в 1,5 и 2,5 раза по сравнению со скоростью окисления этанола. Таким образом, обнаружено, что с различными субстратами биокатализ идет по-разному, что свидетельствует о наличии субстратной специфичности АДГ дрожжевой. Выявлен наиболее оптимальный субстрат – этанол, для которого значение Ккат максимально и составляет (9,23±0,19)·10-2с-1.

Следует отметить, что изучение ферментативного процесса, катализируемого АДГ, при варьировании концентрации второго компонента субстрата – НАД – позволило получить значения Km и Vmax близкие к тем, что были рассчитаны для ферментативной системы при варьировании второго компонента субстрата-этанола.

Полученные данные согласуются с (Hurley T.D., Bosron W.F., Stone C.L., 1994), где определена субстратная специфичность для АДГ, выделенной из других природных источников (растений и грибов), что подтверждает универсальность полученных результатов.

На первом этапе исследовательской работы разработаны собственные эффективные модификации метода выделения и очистки фермента. Освоен и применен кинетический метод определения ферментативных параметров алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей, а также изучена и установлена субстратная специфичность АДГ дрожжевой, т.е. оптимизированы условия для выполнения последующих этапов дальнейшей работы.

На втором этапе работы определены кинетические параметры каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в системе контроля (сравнения), включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), но при варьировании концентрации НАД (0,5–5,5)10-2М (ферментативная система-1). В ходе определения активности АДГ печени лошади построены кинетические зависимости изменения оптической плотности (D) во времени (t) в системе контроля для следующих концентраций НАД (0,5–5,5)10-2М. Кинетические зависимости имели стандартный вид кривых с насыщением. По освоенной схеме построены спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера–Берка и рассчитаны параметры Кm, Ккат и Vmax для ферментативной системы-1, включающей АДГ печени лошади (табл. 2).

Таблица 2

Показатели ферментативной активности АДГ пекарских дрожжей и АДГ печени лошади при использовании водного раствора

субстрата этилового спирта

Km,·10-5 М Vmax,·10-5 опт.ед./с Ккат, ·10-1с-1
АДГ пекарских дрожжей 2,85±0,19 3,86±0,18 9,23±0,18
АДГ печени лошади 2,51±0,17 3,51±0,17 8,94±0,17

По особенностям построения первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур (Forsht A.., 1995) а также по механизму каталитического действия (Курганов Б.И., 2008) эти два фермента (АДГ дрожжевая и АДГ печени лошади) практически идентичны. Близкие значения ферментативных параметров АДГ дрожжевой и АДГ печени лошади позволили провести исследование по влиянию эффекторов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) на АДГ печени лошади (коммерческий препарат) в модельных системах.

На третьем этапе исследовано влияние фармакологического препарата Пирацетама на каталитические параметры АДГ печени лошади в ферментативной системе-2, содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2М) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)10-2М и в ферментативной системе-3, включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)10-2М. Для сравнения кинетических параметров в ферментативной системе-2 и ферментативной системе-3 применили три способа изучения ферментативных характеристик биокатализатора:

1. Оценочный по выявлению возможного влияния и Пирацетама, и НАД (при варьировании их концентраций) на каталитическую активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. На кривых D~t определяли Vmаx и строили зависимости в координатах Vmаx – концентрация Пирацетама.

2. В рамках классической энзимологии строили кинетические зависимости D~t. К начальным участкам полученных кривых проводили касательные и определяли начальные скорости (V0). Экспериментальные данные обрабатывали, используя способ, предложенный Лайнуивером–Берком, и рассчитывали важнейшие ферментативные параметры Vmаx, Km и Kкат.

3. Построение геометрического «портрета» изучаемой реакции, катализируемой АДГ, в трехмерной Kм'V' системе прямоугольных координат для расчета дополнительных ферментативных параметров (длин -, -, - векторов).

Для ферментативной системы-2 в рамках 1-го способа находили концентрацию Пирацетама, при которой активность АДГ максимальная. Для этого посредством изучения кривых D~t рассчитали значение Vmаx и строили экспериментально полученную зависимость в координатах Vmаx – концентрация Пирацетама (рис. 5).

Рис. 5. Влияние концентрации Пирацетама на скорость фермента-тивной реакции (Vmаx), катализируемой АДГ (2,41·10-4М), кинетика которой описывается уравнением Михаэлиса Ментена

Обнаружили, что концентрация Пирацетама влияет на активность АДГ печени лошади, причем оптимальной является концентрация эффектора, равная 1,5·10-2М, при которой значение Vmаx составляет (19,80±0,32) 10-5опт.ед./с.

Обработка экспериментальных данных по 2-му способу с использованием координат Лайнуивера–Берка позволила получить следующие значения биокаталитических характеристик для ферментативной системы-2: Кm = (8,47 ± 0,37)·10-5 моль/л; Vmах = (20,01 ± 0,37)·10-5 опт.ед./с; Ккат = (8,71 ± 0,37)·10-5с-1.

Таким образом, обнаружена корреляция значений ферментативных параметров Vmax, рассчитанных при использовании 1-го и 2-го способов, а именно значение Vmax по 1-му способу равно (19,80±0,32)·10-5 опт.ед./с, а по 2-му – (20,01±0,37) ·10-5 опт.ед./с (табл.3).

Итак, введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значение Km на 71 % больше, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции, а именно в 5,7 раз возрастает значение Vmax при использовании 1-го и 2-го способов.

Таблица 3

Рассчитанные каталитические характеристики фермента АДГ печени лошади (2,41·10-4М) для концентрации Пирацетама 1,5·10-2М при рН 6,0

Ферментативные параметры 1-й способ 2-й способ Система контроля
Кm, ·10-5М - 8,47±0,37 2,51±0,17
Vmах, ·10-5 опт.ед./с 19,80±0,32 20,01±0,37 3,51±0,17

В результате введения в ферментативную систему Пирацетама (1,5·10-2М) повышается активность АДГ, что, возможно, может привести к усиленному окислению этанола в организме человека и, следовательно, к уменьшению его интоксикации (Consalvi V., 1998; Gough W.H., 2001).

В связи с тем, что важная роль в биокаталитической реакции принадлежит НАД, необходимо определить оптимальную концентрацию этого компонента в модельной ферментативной системе. Для этого изучали возможное влияние различных концентраций НАД на активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. Это позволило построить зависимость начальной скорости реакции (Vо) от концентрации НАД (рис.6).

Рис 6. Зависимость максимальной скорости реакции от концентрации НАД для ферментативной системы-3

Значение концентрации НАД, составляющей 1,5·10-2М, является оптимальным для ферментативной системы-2, поскольку зависимость имеет вид кривой с насыщением (рис. 6).

Рассчитали следующие значения Кm, Ккат и Vmах для ферментативной системы-3 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), Пирацетам (1,5·10-2М), С2Н5ОН (1,5·10-2М) и НАД (0,5–4,5)10-2М и сравнили с полученными кинетическими параметрами для ферментативной системы-2 (табл. 4).

Таблица 4

Кинетические параметры ферментативной реакции (Km и Vmax)

для водных растворов АДГ, рассчитанные по двум способам (1-й и 2-й) для ферментативной системы-2 и ферментативной системы-3

Кm,·10-5 моль/л Vmax, 10-5 опт.ед./с
1-й способ 2-й способ 1-й способ 2-й способ
Ферментативная система-2 - 8,47±0,39 19,80±0,32 20,01±0,39
Ферментативная система-3 5,89±0,39 5,03±0,39 11,78±0,38 12,01±0,38
Система контроля 2,51±0,17 3,51±0,17

Обнаружена корреляция ферментативных параметров Кm и Vmах, рассчитанных 2-мя способами. Значения Km, полученные при использовании 2-го способа, в ферментативной системе-3 ниже в 1,5 раза в сравнении с ферментативной системой-2. В случае параметра Vmax наблюдали так же, как и в предыдущем случае, снижение этой характеристики в 1,7 раза при применении и 1-го, и 2-го способов. Кроме того, выявлено, что кинетические параметры активности АДГ печени лошади (Кm и Vmax) зависят от концентрации и Пирацетама, и НАД.

Обращает на себя внимание, что для концентраций и Пирацетама, и НАД, равных 1,5·10-2М, скорости ферментативного процесса максимальны и в случае ферментативной системы-2, и для ферментативной системы-3.

Таким образом, изучив ферментативную систему-2 и ферментативную систему-3, нашли оптимальные условия окисления этилового спирта (1,5·10-2М) при концентрациях компонентов модельной системы: АДГ печени лошади – 2,41·10-4М, Пирацетама – 1,5·10-2М и НАД – 1,5·10-2М в условиях рН 6,0.

Используя найденные изменения параметров Km и V в ферментативной системе-3 при сравнении с системой контроля, выявили тип активации.

Прямая 2 располагается ниже прямой 1 системы контроля (ферментативная система-1), что, согласно классификации В. И. Крупянко, соответствует двухпараметрически рассогласованной активации, т.е. IIa-типу активации АДГ.

Рис. 7. Зависимости обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстрата НАД для водного раствора АДГ (2,41·10-4 М) в ферментативной системе-1 (прямая 1) и ферментативной системе-3 (прямая 2)

На четвертом этапе определяли влияние фармакологических добавок Зорекса и Унитиола на каталитическую активность АДГ печени лошади при изучении влияния различных концентраций НАД, осуществляющих биокатализ в ферментативной системе-4 и ферментативной системе-5. Ферментативная система-4 включала следующие компоненты: АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5,0·10-4М). Кинетические зависимости D~t строили при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0) 10-2М. Ферментативная система-5 состояла из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5,0·10-4М) и включала различные концентрации НАД (1,5–5,0) 10-2М.

При построении экспериментальных кинетических зависимостей в координатах Лайнуивера–Берка определили важнейшие кинетические параметры для изучаемых систем (табл. 5).

Таблица 5

Рассчитанные данные по ферментативной кинетике для ферментативной системы-1, ферментативной системы-4 и ферментативной системы-5

Km, ·10-5 М Vmаx,·10-5 опт.ед./с Kкат, ·10-2с-1 Тип активации
Система контроля (ферментативная система-1) 2,51±0,17 3,51±0,17 8,94±0,17 -
Зорекс (ферментативная система-4) 2,03±0,17 6,62±0,17 1,63±0,17 Ia
Унитиол (ферментативная система-5) 2,42±0,16 6,34±0,16 1,48 ±0,16 Ia

Видно, что введение в ферментативную систему фармпрепаратов Зорекса и Унитиола (табл. 5) приводит к снижению значения Km на 16 – 20 %, и следовательно, улучшается взаимодействие фермента (АДГ печени лошади) и субстрата (C2H5OH) в сорбционном участке активного центра фермента. Этому могут способствовать особенности строения активного центра АДГ печени лошади (Крупянко В.И., 1994).

Наблюдали значительное уменьшение значений константы Kкат (табл. 5) и в ферментативной системе-4, и в ферментативной системе-5. Это свидетельствует о том, что в фармпрепарате Зорекс составляющая часть – Унитиол (ферментативная система-5) – действительно играет доминирующую роль в регуляции каталитического поведения АДГ, усиливая практически в 2 раза каталитическое действие фермента. На основе полученных закономерностей в изменении важнейших ферментативных параметров АДГ по классификации В. И. Крупянко установили тип активации – двухпараметрически согласованная активация – Iа-тип активации АДГ.

В условиях оптимального соотношения концентраций всех компонентов реакционной среды, а именно АДГ, этанола, НАД, Пирацетама, Зорекса и Унитиола, рассчитаны ферментативные параметры (табл. 6).

Таблица 6

Значения каталитических характеристик АДГ при введении фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола

Фермента-тивные системы Эффекторы Молеку-лярная масса Km, ·10-5М Vmax, ·10-4 опт.ед./с Тип акти- вации
1 Контроль - 2,51±0,17 3,51±0,17 -
3 Пирацетам 142,16 5,03±0,39 20,01±0,39 IIa
4 Зорекс 630,09 2,03±0,17 6,62±0,17 Ia
5 Унитиол 124,23 2,12±0,16 6,34±0,16 Ia

Пирацетам в большей степени влияет на образование фермент-субстратного комплекса. Суммарный наблюдаемый эффект – ослабление взаимодействия фермента и субстрата при введении Пирацетама. Именно в этих условиях активность алкогольдегидрогеназы максимальна. Следовательно, при добавлении Пирацетама этанол с участием АДГ утилизируется наиболее эффективно.

Рассчитанные ферментативные параметры и соответственно типы активации фермента для фармпрепаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол в ферментативных системах имеют разнонаправленный характер изменений: в случае Пирацетама – тип активации IIa, а в случае Зорекса и Унитиола – тип активации Ia. Это не позволило провести сопоставление найденных значений ферментативных параметров АДГ, так как типы активации различны. Поэтому наряду с первым и вторым способами определения ферментативных параметров был применен ещё один способ анализа значений ферментативных параметров – это метод векторного построения полученных экспериментальных данных в Kм' V'– системе координат.

На основе данных табл. 6 построили кривую течения – геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой АДГ печени лошади (рис. 8).

Рис.8. Пространственная кривая АДГ-реакции в трехмерной Kм' V' системе координат, активируемой фармпрепаратами Зорекс (3), Унитиол (1) и Пирацетам (2)

На основе рис.8. рассчитали дополнительный ферментативный параметр – интенсивность активации для трех обсуждаемых ферментативных систем и сравнили длины -, -, -векторов (табл. 7). Именно этот интегральный параметр несет обобщенную количественную информацию об интенсивности активации фермента.

Таблица 7

Значения длин -, -, -векторов

Ферментативные системы Длины - векторов, у.е.
Пирацетам 3 2,50
Зорекс 4 0,48
Унитиол 5 0,39

Самым действенным для АДГ среди изученных фармпрепаратов является Пирацетам (2,50 у.е.). Эффективность фармпрепаратов Зорекс и Унитиол в сравнении с Пирацетамом в 5,2 раз ниже. Кроме того, данные табл. 7 указывают на преобладающий вклад компонента Зорекса в сравнении с Унитиолом. Обращает на себя внимание то, что при введении в ферментативную систему изученных фармпрепаратов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) меняются не только тип активации, но и механизм изучаемой каталитической реакции, а также её интенсивность.

Таким образом, впервые разработанный и апробированный многоэтапный научно-методический подход позволил детально изучить ферментативное поведение АДГ при добавлении Пирацетама, Зорекса и Унитиола и может служить основой для изучения других фармпрепаратов.

ВЫВОДЫ

  1. Выделена и очищена алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей. Рассчитано содержание фермента, изучена субстратная специфичность и исследованы важнейшие ферментативные параметры биокатализатора. Выявлена максимальная субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы дрожжевой к этанолу.
  2. Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы в модельной ферментативной системе в присутствии регуляторов каталитической активности:
  • для системы контроля определены значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади: Кm = (2,51 ± 0,17)·10-5 моль/л; Vmax = (3,51 ± 0,17)·10-5 опт.ед./с; Ккат = (8,94 ± 0,17)·10-2 с-1. Найдено удовлетворительное соответствие ферментативных показателей алкогольдегидрогеназы печени лошади и алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей;
  • введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значения Km больше на 71 %, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции (в 5,7 раз возрастает значение Vmax) при использовании 1-го и 2-го способов. Наибольшее влияние на алкогольдегидрогеназу найдено для концентрации Пирацетама, составляющей 1,5·10-2М;
  • наиболее эффективное течение ферментативного процесса наблюдается для концентрации никотинамидадениндинуклеотида равной 1,5·10-2М;
  • каталитическая активность алкогольдегидрогеназы возрастает в 2,6 раза при добавлении Зорекса в модельную систему, а в случае с Унитиолом найдено двукратное возрастание активности биокатализатора. Введение в ферментативную систему Зорекса и Унитиола на 16 – 20 % улучшает взаимодействие фермента (алкогольдегидрогеназы печени лошади) и субстрата (C2H5OH) в сравнении с системой контроля.

3. При введении в модельную ферментативную систему Пирацетама установлен тип активации – IIа-тип (двухпараметрически рассогласованная активация). При использовании Зорекса и Унитиола алкогольдегидрогеназа активируется по Iа-типу (двухпараметрически согласованная активация).

4. Построена и проанализирована пространственная кривая течения кинетической реакции для алкогольдегидрогеназы, её геометрический «портрет», при добавлении в ферментативную систему Пирацетама, Зорекса и Унитиола. Установлено, что введение изученных фармпрепаратов в модельную систему с алкогольдегидрогеназой меняет не только интенсивность, но и тип и механизм изученной ферментативной реакции. Рассчитан дополнительный ферментативный параметр – длина вектора, показавший, что наиболее эффективным для активации алкогольдегидрогеназы является фармпрепарат Пирацетам.

Список опубликованных работ по теме диссертации

  1. Сметанникова Н.В. Ферментативные характеристики алкогольдегидрогеназы // Сб. тез. V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета, посвященной 35-летию Тверского государственного университета. – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2006. – С. 30.
  2. Лапина Г.П., Сметанникова Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. I Междунар. конф. «Состояние воды в биологических и модельных системах» Тверская гос. мед. академия. – Тверь, 2007. – С. 173.
  3. Лапина Г.П. Золотарева Н.В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. VII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского государственного университета. – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2008. – С. 25.
  4. Золотарева Н.В. Воздействие Пирацетама на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Тез. докл. XVI Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2009. – С.39.
  5. Золотарева Н.В. Геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой, в присутствии различных эффекторов // Тез. докл. XVII Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2010. – С.34.
  6. Золотарева Н.В. Создание научно-методических основ исследования влияния фармакологических препаратов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Материалы конференции. Всероссийская научная школа для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных каталитических превращений». – Тверь: ТГСХА, 2010. – С. 5–7.

Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:

  1. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Пирацетам – регулятор каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2009. – Вып.11, №2. – С.56–62.
  2. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Оптимизация течения ферментативной реакции с участием алкогольдегидрогеназы печени лошади при варьировании концентрации никотинамидадениндинуклеотида // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2009. Вып.13, №14. – С.85–90.
  3. Лапина Г.П., Золотарева Н.В. Анализ данных ферментативной кинетики с использованием трехмерной Kм'V' – системы координат // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2010. – Вып.17, №.16. – С.71–76.


 


Похожие работы:

«ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии ФГУН ГНЦ ПМБ ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный...»

«Жиренкина Екатерина Николаевна Особенности очага висцерального лейшманиоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Понировский Евгений...»

«Шрамко Павел Александрович РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОТБОРА ПЕРСПЕКТИВНЫХ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS Специальности: 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук ОБОЛЕНСК-2012 Работа выполнена в лаборатории аэробиологических испытаний Федерального бюджетного учреждения науки Государственный...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ МАРТ авторефераты 1. Александрова, Наталья Владимировна. Состояние системы мать-плацента-плод, течение и исходы беременности, наступившей с использованием вспомогательных репродуктивных технологий : автореферат диссертации. доктора медицинских наук : 14.01.01 / Н. В. Александрова ; конс.: О. Р. Баев, Г. Т. Сухих ; Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В. И. Кулакова (М.). - М. : б. и., 2013. - 46 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1).

«УДК 579.22.577.121 ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном...»

«Гюнтер Елена Александровна Пектиновые вещества клеточных культур растений 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Сыктывкар - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научные консультанты: академик РАН, доктор химических наук, профессор Оводов Юрий Семенович доктор биологических наук, доцент...»

«НОВЫЕ ПОСТУПЛЕНИЯ В БИБЛИОТЕКУ Авторефераты Январь-2013 1. Аббасова, Самира Фуад кызы. Возможности видеоэндоскопического хирургического лечения хронического калькулезного холецистита у лиц пожилого возраста : автореферат диссертации. кандидата медицинских наук : 14.01.17 / С. Ф. Аббасова ; Российский университет дружбы народов (М.), кафедра госпитальной хирургии. - М. : б. и., 2013. - 19 с. Экземпляры: всего:1 - анл(1). 2.

«МИНВАЛЕЕВ Ринад Султанович ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИСЕРДЕЧНОГО И ВНУТРИОРГАННОГО КРОВОТОКА ПРИ ИЗБРАННЫХ ПОЗАХ ЧЕЛОВЕКА (ПО ДАННЫМ ДОППЛЕРЭХОГРАФИИ) 03.00.13 - физиология человека и животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 1999...»

«­ Краевский Сергей Владимирович АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2011 Работа выполнена в ФГУП Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики. Научные руководители : кандидат биологических наук Игнатюк Т. Е. кандидат...»

«Богун Александр Геннадьевич Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск 2010 г. Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной...»

«АГЕЕВ Сергей Андреевич КОНСТРУИРОВАНИЕ АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ YERSINIA  PESTIS С ПОНИЖЕННОЙ РЕАКТОГЕННОСТЬЮ 03.02.03– микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав...»

«Низова Анастасия Валерьевна Изучение устойчивости к лекарственным препаратам первой и второй линии штаммов Mycobacterium tuberculosis, выделенных от больных с хроническим течением туберкулеза 03.00.07 – Микробиология 03.00.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии...»

«Павлов Виталий Михайлович Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis 03.02.03– микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Оболенск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. НАУЧНЫЙ...»

«Новикова Ирина Александровна КОРРЕКЦИЯБИОХИМИЧЕСКОГО СТАТУСА У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ КЕТОЗАХ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Курск – 2013 Диссертационная работа выполнена в ФГБОУ ВПО Орловский государственный аграрный университет. Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Ярован Наталья Ивановна Официальные оппоненты:

«ГАЛЯМОВА Гульмира Калелбаевна БИОГЕОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕКОТОРЫХ ДРЕВЕСНЫХ КУЛЬТУР Г. УСТЬ-КАМЕНОГОРСКА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Астрахань 2013 Работа выполнена в РГП на ПХВ Семипалатинский государственный педагогический институт ФГБОУ ВПО Астраханский государственный технический университет Научный руководитель : Панин Михайл Семенович, доктор биологических наук, профессор Научный...»

«МАРКОВА Юлия Александровна ПОЛИГОСТАЛЬНОСТЬ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАСТЕНИЯМИ 03.02.03-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена в ФГБУ Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека Сибирского отделения Российской академии медицинских наук ГБОУ ДПО Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования Министерства...»






 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.