Сравнительное фармакогностическое исследование долговегетирующих видов рода euphrasia l. флоры пермского края
Мономерами водорастворимых полисахаридов являются глюкоза и ксилоза. В комплексе пектиновых веществ обнаружена только глюкоза. Обязательные компоненты пектиновых веществ – уроновые кислоты не найдены, что вероятно связано с ферментативным или химическим восстановлением карбоксильных групп в процессе экстракции и гидролиза. Гемицеллюлоза А – это природный галактоксилан, а гемицеллюлоза Б – галактоксилоарабан.
РАЗРАБОТКА МЕТОДИКИ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ УГЛЕВОДОВ В РАСТЕНИЯХ РОДА EUPHRASIA
Разработана методика количественного определения углеводов, спектрофотометрическим методом, с использованием антронсерного реактива, в пересчете на глюкозу, как постоянного и доминирующего компонента в растениях рода Очанка.
В ходе последовательного анализа (три этапа) возможно параллельное определение полисахаридов и низкомолекулярных сахаров, а также их суммы из одной навески. С антронсерным реактивом будут взаимодействовать свободные и связанные, полимерные углеводы, а также и углеводные компоненты гетерозидов (рис. 3).
Метрологическая характеристика разработанной методики показала, что относительная ошибка определения суммы полисахаридов и низкомолекулярных сахаров составляет ± 4,7%, а полисахаридов ± 6,5%, при доверительной вероятности 95%.
С целью сравнительной оценки количественного содержания углеводов в долговегетирующих видах была использована разработанная методика. Установлено, что содержание углеводов находится в пределах от 3,91% до 8,65% (рис. 4). Максимальное количество от общей суммы приходится на низкомолекулярные сахара, тогда как полисахариды от общей суммы составляют 10%. Наибольшее количество углеводов накапливается в траве E. officinalis, наименьшее – в траве E. reuteri. По органам углеводы распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в цветках, плодах и листьях, а минимальное – в корнях и стеблях.
Рис. 3. Схема количественного определения углеводов в растениях рода Euphrasia L.
Рис.4. Содержание суммы углеводов в траве растений рода Euphrasia L.
Качественный состав пигментов семи видов рода Euphrasia незначительно отличается и представлен основными фотосинтетическими пигментами высших растений. Обнаружено 11 веществ, в сравнении с аутентичными образцами идентифицированы (по значению Rf и УФ-спектрам элюатов с хроматограмм) -каротин и хлорофилл а. В стандартных условиях в сравнении с литературными данными (по УФ-спектрам элюатов с хроматограмм) – хлорофилл b. Девять веществ по окраске отнесены к производным каротина и ксантофилла (табл. 4, рис. 5).
Таблица 4
Качественный состав пигментов растений рода Euphrasia L.
№ вещества | max | Значение Rf ПЭ : ДЭ (1:10) * | Окраска | Виды | ||||||||
в видимом свете | в УФ свете | после детектирования ** | E. brevipila | E. reuteri | E. murbeckii | E. parviflora | E. officinalis | E. tatarica | E. stricta | |||
1 | - | 0,05 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
2 | - | 0,09 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
3 | - | 0,18 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
4 | - | 0,22 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
5 | - | 0,26 | бледно- желтая | зеленая | - | + | + | + | + | + | + | + |
6 | - | 0,32 | желтая | зеленая | - | + | + | + | + | + | + | + |
7 | 459, 645 | 0,43 | зеленая | красная | - | + | + | + | + | + | + | + |
8 | - | 0,46 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
9 | 432, 666 | 0,53 | темно- зеленая | красная | - | + | + | + | + | + | + | + |
10 | - | 0,63 | - | - | синяя | + | + | + | - | + | - | + |
11 | 424, 452, 480 | 0,70 | - | - | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
Стандартные образцы | ||||||||||||
-каротин | 430, 453, 480 | 0,69 | ярко- желтая | зеленая | синяя | + | + | + | + | + | + | + |
хлорофилл а | 430, 666 | 0,52 | темно- зеленая | красная | - | + | + | + | + | + | + | + |
хлорофилл b | 453, 642*** | - | - | - | - | + | + | + | + | + | + | + |
Примечание: * - петролейный эфир – диэтиловый эфир (1:10); ** - 10% спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты; *** - литературные данные.
Рис. 5. Спектральные характеристики веществ 7, 9 и 11, элюированных с хроматограмм и стандартных веществ: -каротина и хлорофилла а.
Суммарное содержание зеленых пигментов и продуктов их разрушения в исследованных видах рода Euphrasiа в среднем составляет 5,01 мг/г (табл. 5). Содержание феофетинов преобладает над содержанием хлорофиллов. Доминирующими являются феофетин а (его содержание у исследованных видов колеблется от 2,20 до 3,20 мг/г) и хлорофилл а (от 1,20 до 1,70 мг/г). Максимальное количество хлорофиллов и феофетинов обнаружено в E. stricta.
Содержание каротиноидов в растениях рода Euphrasia варьирует от 0,26 до 0,40 мг/г (табл. 6). Наибольшее их количество обнаружено в E. parviflora, а наименьшее – в траве E. reuteri и E. tatarica. Установлено, что на накопление пигментов влияют функциональные особенности органов растений. Максимальное количество обнаружено в листьях, активно участвующих в фотосинтезе, а минимальное в корнях, у которых отсутствует светособирающая функция.
Фотосинтетический аппарат растений рода Euphrasia, характеризующихся полупаразитическим типом питания, является сформированным и прошел успешную адаптацию к природным условиям, о чем свидетельствуют стабильные показатели отношений хлорофилла а (C a) к хлорофиллу b (C b) – 2,5; суммы хлорофиллов к каротиноидам (C a+b/ Сar) –6,2 и их совпадение со значениями данных отношений, установленными для автотрофных растений (табл. 6).
Таблица 5
Содержание хлорофиллов и феофетинов в растениях рода Euphrasia L.
№ п/п | Вид | Содержание, мг/г | |||||
хлорофиллы | феофетины | ||||||
а | b | а+b | а | b | а+b | ||
1 | E. brevipila | 1,37±0,21 | 0,47±0,11 | 1,85±0,09 | 2,48±0,24 | 0,42±0,02 | 2,92±0,21 |
2 | E. reuteri | 1,22±0,13 | 0,61±0,06 | 1,83±0,21 | 2,20±0,09 | 0,66±0,02 | 2,86±0,13 |
3 | E. murbeckii | 1,20±0,22 | 0,53±0,03 | 1,46±0,16 | 2,22±0,08 | 0,50±0,03 | 2,29±0,17 |
4 | E. parviflora | 1,54±0,16 | 0,52±0,03 | 2,15±0,22 | 3,05±0,09 | 0,32±0,07 | 3,14±0,09 |
5 | E. officinalis | 1,54±0,05 | 0,65±0,07 | 2,19±0,24 | 2,81±0,12 | 0,57±0,04 | 3,38±0,22 |
6 | E. tatarica | 1,22±0,08 | 0,51±0,10 | 1,73±0,03 | 2,20±0,05 | 0,41±0,03 | 2,61±0,08 |
7 | E. stricta | 1,70±0,11 | 0,61±0,04 | 2,58±0,13 | 3,20±0,21 | 0,41±0,06 | 4,11±0,15 |
Среднее значение: | 1,40 | 0,56 | 1,97 | 2,59 | 0,47 | 3,04 |
Таблица 6
Содержания пигментов и их отношение в растениях рода Euphrasia L.
№ п/п | Вид | Содержание, мг/г | Отношение | ||||
C a | C b | Сar | Сумма пигментов | C a/C b | C a+b/ Сar | ||
1 | E. brevipila | 1,37 | 0,47 | 0,28 | 2,12 | 2,9 | 6,6 |
1.1 | корни | 0,14 | 0,1 | 0,05 | 0,29 | 1,4 | 4,8 |
1.2 | стебли | 0,99 | 0,55 | 0,21 | 1,75 | 1,8 | 7,3 |
1.3 | листья | 7,21 | 2,87 | 1,71 | 11,79 | 2,5 | 5,9 |
1.4 | цветки | 2,55 | 1,17 | 0,61 | 4,33 | 2,2 | 6,1 |
1.5 | плоды | 1,87 | 1,08 | 0,49 | 3,44 | 1,7 | 6,0 |
2 | E. reuteri | 1,22 | 0,61 | 0,26 | 2,09 | 2,0 | 7,0 |
3 | E. murbeckii | 1,20 | 0,53 | 0,30 | 2,03 | 2,3 | 5,8 |
4 | E. parviflora | 1,54 | 0,52 | 0,40 | 2,46 | 2,9 | 5,2 |
5 | E. officinalis | 1,54 | 0,65 | 0,35 | 2,54 | 2,4 | 6,3 |
6 | E. tatarica | 1,22 | 0,51 | 0,27 | 2,0 | 2,4 | 6,4 |
7 | E. stricta | 1,70 | 0,61 | 0,39 | 2,7 | 2,8 | 5,9 |
В гексановых извлечениях, полученных из травы исследуемых видов рода Euphrasia, обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (октадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонакозан, эйкозан), а так же фитостерин ( - ситостерол) и его предшественник (сквален). Содержание жирных кислот и их альдегидов незначительно (табл. 7).
Таблица 7
Состав гексановых извлечений из растений рода Euphrasia L.
Соединение | Количественное содержание, %* | Степень совпадения с библиотечным масс-спектром, % | |||||||
E. officinalis | E. tatarica | E. | E. reuteri | E. murbeckii | E. brevipila | E. parviflora | |||
Неофитадиен | ---** | --- | --- | --- | --- | 0,60 | --- | 99 | |
Октадекан | --- | --- | --- | 9,45 | --- | 1,11 | --- | 95 | |
Нонадекан | 9,82 | --- | 4,01 | --- | 7,78 | 6,89 | 7,34 | 90 | |
Эйкозан | --- | 6,62 | --- | --- | --- | 6,71 | 3,10 | 98 | |
Гексакозан | 6,68 | --- | 20,90 | --- | 38,49 | --- | 27,69 | 91 | |
Гептакозан | --- | --- | --- | 9,79 | --- | 7,08 | --- | 99 | |
Октакозан | 33,62 | --- | 6,28 | --- | 7,19 | 2,85 | 7,50 | 83 | |
Нонакозан | --- | 14,24 | --- | 21,47 | --- | 35,38 | --- | 97 | |
2-Нонакозанон | --- | --- | 0,56 | --- | --- | --- | --- | 94 | |
Сквален | 1,96 | 1,48 | --- | 2,97 | --- | --- | --- | 92 | |
- Ситостерол | 1,56 | --- | 28,16 | 2,67 | 10,87 | 21,32 | 15,03 | 93 | |
Додекановый (лауриновый) альдегид | 2,05 | --- | --- | --- | 0,59 | --- | --- | 91 | |
Тетрадекановый (миристиновый) альдегид | 1,86 | --- | --- | --- | 0,42 | --- | --- | 95 | |
Гексадекановая (пальмитиновая) кислота | 2,81 | --- | 7,75 | 1,59 | 5,32 | --- | 10,05 | 93 | |
Октадекановая (стеариновая) кислота | --- | --- | 1,91 | --- | --- | --- | --- | 91 | |
9,12-октадекадиеновая (линолевая) кислота | --- | --- | --- | --- | --- | --- | 1,91 | 99 | |
9,12,15-Октадекатриеновая (линоленовая) кислота | --- | --- | 15,92 | --- | 6,04 | --- | 6,93 | 93 | |
9-Октадеценовая (олеиновая) кислота | --- | --- | --- | --- | --- | --- | 2,91 | 86 | |
Тиомочевина | 4,22 | --- | --- | --- | --- | --- | --- | 80 | |
6,10,14-триметил-2-пентадеканон (гексагидрофарнезил-ацетон) | --- | --- | 0,27 | --- | --- | 0,48 | --- | 97 | |
1,2-Бензолдикарбоновая (фталевая) кислота | --- | --- | --- | --- | --- | 0,66 | --- | 97 | |
Фитол | --- | --- | --- | --- | --- | 1,24 | --- | 91 |
Примечание: * - содержание компонентов в нормировочных процентах от суммы площадей всех зарегистрированных пиков; ** - содержание соединения относительно суммы всех пиков менее 0,005% или его отсутствие.
Сравнительный анализ долговегетирующих видов показал, что компонентный состав липофильных веществ варьирует от трех (E. tatarica) до одиннадцати (E. brevipila) веществ, у E. officinalis, E. stricta и E. parviflora представлен девятью веществами.
Суммарное содержание идентифицированных липофильных компонентов в растениях рода Euphrasia убывает в ряду E. stricta > E. brevipila > E. murbeckii > E. parviflora > E. officinalis > E. reuteri > E. tatarica.
Фармакологические свойства растений рода Euphrasia
Проведена сравнительная оценка антикоагулянтной активности сухих водных и спиртовых экстрактов из долговегетирующих растений рода Euphrasia флоры Пермского края.
Наиболее высокая антикоагулянтная активность отмечена у спиртовых экстрактов из травы E. reuteri (22,5%) и E. stricta (21,3%), водного из E. murbeckii (23,5%), а так же водного и спиртового из E. parviflora (22,5 и 22,0% соответственно). Остальные экстракты проявляют активность в пределах от 15,3 до 19,1% (табл. 8).
Таблица 8
Антикоагулянтная активность сухих экстрактов
из растений рода Euphrasia L.
№ п/п | Вид | Экстрагент | Время свертывания, с | Изменение свертываемости, % | Р | ||||
контроль | опыт | ||||||||
1 | E. brevipila | вода | 30,5±0,63 | 34,5±0,79 | – 16,6 | < 0,002 | |||
спирт | 29,9±0,53 | 34,4±1,20 | – 15,3 | < 0,01 | |||||
2 | E.
| вода | 29,7±1,26 | 35,1±1,75 | – 18,3 | < 0,02 | |||
спирт | 28,2±1,16 | 34,5±1,44 | – 22,5 | < 0,002 | |||||
3 | E. parvifora | вода | 26,6±1,24 | 32,6±1,73 | – 22,5 | < 0,02 | |||
спирт | 26,4±1,13 | 32,2±1,35 | – 22,0 | < 0,02 | |||||
4 | E. officinalis | вода | 28,2±0,58 | 33,4±1,27 | – 18,5 | < 0,002 | |||
спирт | 20,9±1,07 | 24,9±0,93 | – 19,1 | < 0,01 | |||||
5 | E. tatarica | вода | 20,5±0,89 | 24,1±1,43 | – 17,7 | < 0,05 | |||
спирт | 35,3±1,49 | 41,2±1,84 | – 16,7 | < 0,05 | |||||
6 | E. murbeckii | вода | 22,6±1,21 | 27,9±0,94 | – 23,5 | < 0,01 | |||
спирт | 22,7±1,17 | 26,8±0,15 | – 18,1 | < 0,02 | |||||
7 | E. stricta | вода | 14,6±0,62 | 17,4±0,72 | – 18,8 | < 0,02 | |||
спирт | 18,6±0,64 | 22,6±0,42 | – 21,3 | < 0,001 | |||||
8 | Гепарин | --- | 29,9±0,48 | 36,6±1,82 | – 22,4 | < 0,01 |
Установлена антирадикальная активность (АРА) у исследуемых видов рода Euphrasia. Время полураспада стабильного радикала ДФПГ изменяется в пределах 0,5 – 27 мин. Наиболее высокую активность показали извлечения из E.murbeckii, E. brevipila, E. tatarica, E. stricta (0,5 – 6 мин). Низкая антирадикальная активность обнаружена у извлечений из E. reuteri, E. officinalis и E. parviflora (18 – 27 мин). Степень выраженности антирадикальной активности изученных видов зависит от содержания в них фенольных соединений и иридоидов (рис. 6). Коэффициент корреляции составляет - 0,841 и - 0,681, соответственно.
окисляемые вещества; флавоноиды; иридоиды; АРА, мин.
Рис. 6. Зависимость между АРА ( 1/2) и количественным содержанием БАВ в растениях рода Euphrasia L.
Наибольшей антирадикальной активностью обладают извлечения из генеративных органов - цветков и плодов (не более 0,5 мин). Низкую активность показали извлечения из корней и стеблей (45 мин). Антирадикальная активность травы составила 2 минуты, что объясняется большим удельным весом в массе растения листьев, цветков и плодов.
Сухие спиртовые экстракты всех исследуемых видов рода Euphrasia малотоксичны, ЛД50 при введении в желудок – более 5000 мг/кг.
Анализ результатов биологических испытаний подтверждает целесообразность использования растений рода Euphrasia в научной медицине и позволяет рекомендовать их для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и антирадикальной активностью.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
- Изучено морфолого-анатомическое строение четырех перспективных видов рода Euphrasia, произрастающих в Пермском крае: E. officinalis, E. tatarica, E. murbeckii и E. stricta. Методом сравнительного анализа с морфологически близкими ранее изученными видами (E. reuteri, E. brevipila, E. parviflora), определен комплекс низковариабельных признаков для диагностики цельного и измельченного сырья, включенный в проект изменения к ФС «Очанки трава».
- Установлено, что исследованные виды рода Euphrasia имеют близкий химический состав продуктов вторичного метаболизма, представленный флавоноидами, иридоидами и фенолкарбоновыми кислотами. С помощью аутентичных образцов доказано наличие цинарозида, хлорогеновой кислоты и аукубина. Данные вещества являются константными для рода Euphrasia и могут использоваться в фармацевтическом и хемосистематическом анализе.
Изучено количественное содержание основных групп БАВ, наибольшее количество накапливается в траве и органах E.murbeckii, а наименьшее в E. officinalis и E. stricta. Среднее содержание БАВ, установленное для рода составляет: флавоноидов – 6,11%; иридоидов – 0,33%; окисляемые вещества – 7,81% и сопоставимо с результатами, полученными ранее.
- Разработаны и включены в проект изменения к ФС «Очанки трава» числовые показатели, регламентирующие доброкачественность цельного и измельченного сырья (флавоноидов в пересчете на цинарозид не менее 2%; экстрактивных веществ, извлекаемых 40% спиртом, не менее 20%; и др.), с учетом дополнительных производящих растений: E. officinalis, E. tatarica, E. murbeckii, E. stricta.
- Изучен качественный состав и количественное содержание продуктов первичного метаболизма и пигментов в траве и органах семи видов рода Euphrasia: E. officinalis, E. tatarica, E. murbeckii, E. stricta, E. reuteri, E. brevipila и E. parviflora.
Установлено наличие 12 аминокислот, в том числе 3-х незаменимых. Из них идентифицированы: орнитин, аргинин, пролин, глутаминовая кислота, аланин, аспарагин, серин, валин, изолейцин. Количественное содержание свободных аминокислот в траве находится в пределах 0,82 – 1,64%.
Компонентный состав углеводов представлен шестью веществами, при этом глюкоза, галактоза, ксилоза, арабиноза и рамноза присутствуют как в свободном, так и в связанном состоянии. Содержание углеводов в траве находится в пределах от 3,91% до 8,65%, максимальное количество от общей суммы приходится на низкомолекулярные сахара.
Пигменты исследуемого рода представлены 11 веществами, три из которых идентифицированы как -каротин, хлорофилл а и b, девять веществ отнесены к производным каротина и ксантофилла. Суммарное содержание зеленых пигментов и продуктов их разрушения в траве в среднем составляет 5,01 мг/г. Содержание каротиноидов варьирует от 0,26 до 0,40 мг/г.
По органам исследуемые вещества распределены неравномерно, их максимальное количество установлено в генеративных органах (аминокислоты и углеводы) и листьях (пигменты), а минимальное – в корнях и стеблях.
В гексановых извлечениях обнаружено 16 липофильных компонентов, доминирующими являются: высшие алканы (октадекан, нонадекан, гексакозан, октакозан, нонакозан, эйкозан), а так же фитостерин ( - ситостерол) и его предшественник (сквален). Содержание жирных кислот и их альдегидов незначительно.
- Разработана методика количественного определения углеводов в сырье очанки, позволяющая проводить поэтапное определение содержания низкомолекулярных сахаров и полисахаридов, а также их суммы из одной навески. Относительная ошибка метода определения суммы полисахаридов и низкомолекулярных сахаров составляет ± 4,7%, а полисахаридов – ± 6,5%.
- Установлено, что растения рода Euphrasia перспективны для разработки фитопрепаратов с антикоагулянтной и антирадикальной активностью. В результате определения острой токсичности сухие спиртовые экстракты из исследуемых растений отнесены по общепринятой классификации к группе малоопасных.
Список опубликованных работ
- Абдуллина, Е. С. Сравнительный морфологический анализ Euphrasia hirtella и Euphrasia tatarica (Scrophulariaceae) // Е. С. Абдуллина, О. А. Кроткова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2006. – №1. – С. 92.
- Кроткова, О. А. Сравнительный анализ анатомического строения Euphrasia tatarica Fisch. и Euphrasia fennica Kihlm. (Scrophulariaceae) / О. А. Кроткова, Е. С. Абдуллина // Там же. – С. 244 - 246.
- Кроткова, О. А. Сравнительное исследование флавоноидов Euphrasia tatarica (Scrophulariaceae), произрастающей в Уральском регионе/ О. А. Кроткова, Т. В. Сухинина // Актуальные вопросы судебно-химических, химико-токсикологических исследований и фармацевтического анализа: Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, 28 сентября – 3 октября 2009 г., Пермь, ГОУ ВПО ПГФА Росздрава, 2009. – С. 153 - 156.
- Петриченко, В. М. Биологические и химические свойства растений семейства норичниковые / В. М. Петриченко, … О. А. Кроткова и др. // Региональный конкурс РФФИ - Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2007-2009 гг. Сб. статей. Ч. 2. Пермь: ПНЦ УрО РАН, 2010. – С. 113 - 117.
- Кроткова, О. А. Фенольные соединения Euphrasia officinalis / О. А. Кроткова, Т. В. Сухинина, В. М. Петриченко // Актуальные проблемы современной науки и образования. Биологические науки: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Т. II. – Уфа: РИЦ БашГУ, 2010. – С. 418 - 422.
- Кроткова, О. А. Компонентный состав иридоидов некоторых видов рода очанка флоры Пермского края / О. А. Кроткова, Е. А. Булгакова, Е. А. Мальцева, Е. П. Смирнова // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2010. – №6. – С. 211 - 213.
- Кроткова, О. А. Влияние места произрастания на содержание биологически активных веществ в очанке лекарственной / О. А. Кроткова, М. В. Мельник, Е. С. Солодникова, В. А. Захарова // Там же. – С. 213 - 216.
- Бомбела, Т. В. Подлинность и количественное определение действующих компонентов настойки очанки коротковолосистой / Т. В. Бомбела, … О. А. Кроткова и др. // Вестник Пермской государственной фармацевтической академии. – 2010. – №7. – С. 28 -