Исследование содержания фенолокислот в лекарственном и пищевом растительном сырье методом вэжх
На правах рукописи
МЕДВЕДЕВ ЮРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
ИССЛЕДОВАНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ФЕНОЛОКИСЛОТ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ПИЩЕВОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
МОСКВА – 2010
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия
имени И.М. Сеченова
Научные руководители:
Академик РАМН, доктор фармацевтических наук,
профессор Арзамасцев Александр Павлович
Доктор химических наук, профессор Эллер Константин Исаакович
Доктор фармацевтических наук,
профессор Прокофьева Вера Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Киселева Татьяна Леонидовна
доктор фармацевтических наук Боковикова Татьяна Николаевна
Ведущая организация:
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН
Защита состоится «_____» __________________2010 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской Медицинской Академии им. И. М. Сеченова, по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д.49
Автореферат разослан «_____»_________________2010 г.
| Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09, | ||
| доктор фармацевтических наук, профессор | Наталья Петровна Садчикова | |
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Гидроксикоричные кислоты (ГКК) являются наиболее распространенными полифенольными кислотами в высших растениях. Основными ГКК являются: кафтаровая, хлорогеновая и её изомеры, цикориевая, изомеры дикофеоилхинной (цинарина), феруловая, ферулоилхинная и её изомеры.
ГКК проявляют выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства в тестах in vitro, описаны иммуностимулирующая, противовирусная и противовоспалительная активность.
В настоящее время в отечественной нормативной документации на лекарственные растения и продукты на их основе ГКК упоминается редко (для эхинацеи и артишока). Для BP 2009, USP 30, JP 15 характерно большее количество лекарственных растений, в которых нормируется содержание ГКК (трава и корни эхинацеи, листья артишока, листья ясеня обыкновенного, цветки белокудренника черного, листья крапивы двудомной, листья розмарина лекарственного, листья мелисы лекарственной, корневища и корни шалфея лекарственного). Однако, учитывая важную физиологическую роль для растений можно предположить гораздо большее распространение ГКК.
Другой актуальной проблемой является разработка и внедрение унифицированного метода анализа ГКК, позволяющего определять больший спектр кислот, чем в действующей нормативной документации.
Учитывая вышесказанное, актуальной является разработка унифицированного метода анализа ГКК и исследование с его помощью различного лекарственного растительного сырья, растительных экстрактов, БАД к пище и пищевых продуктов.
Цель и задачи исследования: Цель настоящей работы заключалась в исследовании различных лекарственных и пищевых растительных источников на содержание гидроксикоричных кислот.
Задачи исследования:
- Изучить распространение, физико-химические свойства и методы анализа гидроксикоричных кислот.
- Разработать методику определения гидроксикоричных кислот (подбор оптимальных условий выделения, детектирования и хроматографического разделения фенолокислот в многокомпонентных смесях).
- Оценить хроматографические параметры метода количественного определения, его метрологические характеристики, провести валидацию метода.
- Проанализировать образцы лекарственного и пищевого растительного сырья.
- Создать базу данных о содержании гидроксикоричных кислот в исследованном лекарственном и пищевом растительном сырье.
Научная новизна. Разработаны оригинальные методики идентификации и количественного определения гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье, БАД к пище и пищевых продуктах.
Практическая значимость. Разработанная методика использована для исследования ГКК в 115 наименованиях лекарственного и пищевого растительного сырья. Методика определения гидроксикоричных кислот включена в «Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище» (дополнение к Р4.1.1672-03, Минздрав РФ).
Методика была успешно применена в НИИ питания РАМН при гигиенической экспертизе более 90 образцов сырья для БАД к пище и БАД к пище в НИИ питания РАМН.
Апробация работы. Результаты исследований доложены на XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (ноябрь 2008 г., г. Москва), на научных конференциях кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии ММА им. И.М.Сеченова (2006 – 2009 гг.); конгрессе «Фитофарм 2008» (июнь 2008 г., Санкт-Петербург), XII Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», (декабрь 2009 г., г. Москва), XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», (2010 г., г. Москва).
Апробация работы проведена на межлабораторной конференции кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И. М. Сеченова (19 января 2010 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе одна статья в издании, рекомендуемом ВАК России.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках НИР кафедры фармацевтической химии ГОУ ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств», № госрегистрации 01.200.110545. «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований. Рег. № 01.2.006.06352».
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы.
Диссертация изложена на 144 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 102 источника, 72 из которых зарубежные. Работа иллюстрирована 21 рисунком и 31 таблицей.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Разработка методики ВЭЖХ количественного определения ГКК: хлорогеновой, неохлорогеновой, криптохлорогеновой, кафтаровой, кофейной, р-кумаровой, феруловой, цикориевой, дикофеоилхинных, дикофейной, ферулоилхинных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.
- Результаты изучения содержания и состава гидроксикоричных кислот в лекарственном и пищевом растительном сырье.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследования
Лекарственное и пищевое растительное сырье, продукты их переработки, БАД к пище, сертифицируемые в НИИ питания РАМН.
Стандартные образцы
При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию ГКК в качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступные индивидуальные вещества (производства «Sigma-Aldrich Co», «Fluka», «ChromaDex»).
Хроматографическая система
Жидкостной хроматограф «Agilent 1100 Series» (США) с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб, термостатом, фотодиодноматричным детектором и масс-детектором «Agilent LC/MSD Trap SL family» (США). Управление системой и обработку полученных хроматограмм осуществляли при помощи программы «Chemstation А.09.03».
Условия хроматографирования и детектирования
Для выбора оптимальной аналитической волны детектирования были изучены УФ-спектры имеющихся стандартов ГКК. Было показано, что ГКК имеют несколько максимумов поглощения: при 220-230 нм и 320-330 нм. Для р-кумаровой кислоты также характерно наличие двух максимумов поглощения в УФ-спектре - при 225-230 нм и 308-313 нм (см. рис. 1 и 2).
В качестве аналитической волны детектирования предпочтительно использование полос поглощения с большей длиной, как более специфичной. Кроме этого коэффициент молярной экстинкции ГКК в диапазоне 320-330 нм (для производных р-кумаровой к-ты 308-313 нм) имеет большую величину по сравнению с диапазоном 220-230 нм.
На основании полученных данных детектирование ГКК при ВЭЖХ исследовании проводили при длине волны 330 нм, детектирование производных р-кумаровой кислоты – при длине волны 310 нм.
Рис. 1. УФ - спектр стандарта хлорогеновой (5-КХК) кислоты.
Рис. 2. УФ - спектр стандарта р-кумаровой кислоты.
Для выбора оптимальных условий (наибольшая чувствительность и специфичность) масс-детектирования и фрагментации ГКК при ВЭЖХ - исследовании были изучены масс-спектры имеющихся стандартов и проведена их фрагментация. Для этого имеющиеся рабочие стандартные растворы вводились непосредственно в масс-детектор.
В дальнейшем масс – детектирование проводили в следующих условиях: ионизация электроспреем с распылением азотом; небулайзер 70 psi; температура осушающего газа 350°С, скорость 12 л/минуту; полярность отрицательная; сканирование в диапазоне 100-800 m/z с разрушением ионов, соответствующим молекулярным массам исследуемых кислот.
В рамках подбора оптимальных условий хроматографического разделения использовались следующие варианты подвижной фазы: изократическое элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5 (в различных соотношениях, от 10 % до 25 % ацетонитрила); градиентное элюирование смесью ацетонитрил – фосфатный буферный раствор 0,025 мМоль с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор трифторуксусной кислоты (ТФУ) с рН=2,5; градиентное элюирование смесью ацетонитрил – водный раствор муравьиной кислоты с рН=2,5. Разделение проводили на колонках Thermo Hypersil ODS (2) column 250x4,6мм 5мкм; Phenomenex Luna C18 (2) 250х4,6мм 5мкм; Supelco Discovery C18 250х4,6мм 5мкм.
В дальнейшем, как наиболее оптимальный, использовался следующий вариант хроматографического разделения:
Подвижная фаза. Компонент A: ацетонитрил; компонент B: к 1 л дистиллированной деионизированной воды добавляли концентрированную муравьиную кислоту до рН 2,5. Форма градиента – линейная: 0 мин 12% «А», 30 мин 25% «А», 40 мин 40% «А», 41 мин 80% «А», 42 мин 80% «А», 43 мин 12% «А», 45 мин 12% «А». Общее время анализа - 45 минут. Скорость потока: 0,9 мл/мин. Объем вводимой пробы: 5-100 мкл. Колонка Supelco Discovery C18 HPLC 250x4,6мм 5мкм; температура термостата 25°С. Примеры хроматограмм представлены на рис. 3 и 4.
Рис. 3. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (УФ-детектор при длине волны 330 нм) на примере экстракта артишока.
В процессе работы был проведен подбор условий проведения экстракции ГКК из растительного сырья и пищевых продуктов (состав экстрагента, время).
Рис. 4. Типичная ВЭЖХ - хроматограмма ГКК (масс-детектор, общий ионный ток) на примере экстракта артишока.
Были исследованы следующие варианты: водные растворы этанола с концентрацией 15%, 30%, 45%, 60%, 75%, 90%, 100%; водные растворы метанола с концентрацией 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%; смесь метанол-этанол-вода (25:25:50); водное извлечение (настой или отвар в зависимости от вида сырья). Проводилось исследование влияния времени на полноту экстракции (15, 30, 45 и 60 минут).
Было показано, что оптимальными условиями экстракции являются использование смеси метанол : вода (6:4) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 минут.
Пробоподготовка
Подготовка проб для анализа растительного сырья: образец сырья тщательно измельчают, отбирают около 1,00 г (точная навеска), помещают в круглодонную колбу объемом 100 мл, экстрагируют 50 мл 60 % раствора метанола в течение 15 минут на кипящей водяной бане с обратным холодильником при перемешивании. После этого пробу обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин, фильтруют, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки 60% метанолом.
Подготовка проб для анализа растительных экстрактов: около 0,5 г (точная навеска) экстракта помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют около 50 мл 60% раствора метанола, растворяют, доводят объем раствора до метки 60 % метанолом.
Подготовка проб для анализа соков: около 10 г (точная навеска) фруктового сока помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем до метки водой.
Полученные растворы тщательно перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм, при необходимости центрифугируют на центрифуге при 14000-15000 об/мин.
Хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы
Были рассчитаны хроматографические характеристики и параметры пригодности хроматографической системы разработанной методики (таблица 1), валидационные характеристики (таблица 2), произведена метрологическая оценка методики (таблица 3).
Таблица 1
Параметры разделения гидроксикоричных кислот в условиях градиентного режима, скорость фазы 0,9 мл/мин, мертвый объем t0=3,1
| ГКК | tR, мин. | k` | N | Asym | Rs | |
| Кофеоилхинная | 5.5 | 0.77 | 11637 | 1.01 | 1,17 1,43 1,05 1,07 1,15 1,11 1,08 1,10 1,15 1,01 1,01 1,13 1,08 1,09 1,03 1,07 1,06 1,08 1,02 1,13 1,06 1,13 1,08 1,05 1,05 1,02 1,05 1,03 1,02 1,04 1,03 1,07 1,02 1,02 1,11 1,05 | 1,94 5,42 0,83 1,22 2,42 1,98 2,31 2,08 3,36 0,71 0,68 2,93 2,98 2,30 0,96 3,23 1,60 2,41 0,89 5,47 3,20 5,43 4,98 1,92 2,95 1,94 3,28 1,68 1,14 1,77 2,03 4,79 2,83 1,94 7,83 5,50 |
| 3-КХК* | 5.9 | 0.90 | 12849 | 1.09 | ||
| Кафтаровая | 7.1 | 1.29 | 14707 | 0.97 | ||
| Кофеоилхинная | 7.
3 | 1.35 | 14050 | 1.04 | ||
| Кофеоилхинная | 7.6 | 1.45 | 15367 | 1.06 | ||
| 5-КХК | 8.2 | 1.67 | 17238 | 0.99 | ||
| 4-КХК | 8.7 | 1.86 | 18937 | 1.01 | ||
| изо-Кафтаровая | 9.3 | 2.00 | 19617 | 1.12 | ||
| Дикофейная | 9.9 | 2.19 | 16356 | 1.05 | ||
| Кофеоилхинная | 10.9 | 2.52 | 23376 | 1.06 | ||
| Кофейная | 11.1 | 2.54 | 26176 | 1.03 | ||
| Кофеоилхинная | 11.3 | 2.56 | 21874 | 1.06 | ||
| Кумароилхинная | 12.2 | 2.90 | 24987 | 0.98 | ||
| 1,5-ДиКХК** | 13.1 | 3.13 | 31619 | 0.99 | ||
| ФХК*** | 13.8 | 3.42 | 31326 | 1.01 | ||
| Кофеоиляблочная | 14.1 | 3.51 | 33178 | 0.98 | ||
| Кумароилхинная | 15.1 | 3.76 | 38015 | 1.02 | ||
| Кофеоилхинный лактон | 15.6 | 3.97 | 39712 | 1.07 | ||
| р-Кумаровая | 16.4 | 4.28 | 34931 | 0.98 | ||
| Кофеоилхинный лактон | 16.7 | 4.38 | 43735 | 1.20 | ||
| Феруловая | 18.6 | 4.97 | 39389 | 1.00 | ||
| Цикориевая | 19.8 | 5.25 | 44874 | 0,97 | ||
| Дикумароилхинный лактон | 21.7 | 5.92 | 71156 | 1.01 | ||
| Кофеоилкумароилхинная | 23.5 | 6.41 | 55934 | 0.90 | ||
| 3,4-ДиКХК | 24.2 | 6.74 | 85559 | 0.98 | ||
| изо-3,4-ДиКХК | 25.2 | 7.06 | 84937 | 1.02 | ||
| 3,5-ДиКХК | 25.9 | 7,17 | 76782 | 1.05 | ||
| Кофеоилферулоилвинная | 27.1 | 7.55 | 92259 | 1.00 | ||
| 4,5-ДиКХК | 27.7 | 7.74 | 96389 | 1.12 | ||
| изо-3,5-ДиКХК | 28.1 | 7.86 | 107738 | 1.06 | ||
| изо-4,5-ДиКХК | 28.7 | 8.15 | 119453 | 1.05 | ||
| Розмариновая | 29.4 | 8.37 | 107631 | 0.99 | ||
| Кофеоилферулоилхинная | 31.1 | 8.93 | 125964 | 1.08 | ||
| Кофеоилферулоилхинная | 32.1 | 9.13 | 130810 | 1.07 | ||
| Кофеоилферулоилхинная | 32.8 | 9.35 | 128736 | 1.09 | ||
| Кофеоилферулоилхинная | 35.5 | 10.34 | 192275 | 1.10 | ||
| Ферулоилхинная | 37.2 | 10.86 | 255730 | 1.06 |
Здесь и далее: *КХК – кофеоилхинная кислота; **диКХК – дикофеоилхинная кислота; ***ФХК – ферулоилхинная килота
Как следует из таблицы эффективность колонки составила от 11637 до 255730 т.т. селективность колонки для всех соединений была более 1,0, а разрешение составило от 0,68 до 7,83.
Таблица 2
Параметры валидации методики ВЭЖХ для количественного определения ГКК в образцах при введении 10 мкл
| ГКК | Предел обнаружения (сигнал-шум 3:1) | Предел кол. определения (сигнал-шум 10:1) | Диапазон линейных концентраций | Коэфф. линей-ности |
| 5-КХК | 2,60 мг/100г | 12,00 мг/100г | 12-10000 мг/100г | 0,997 |
| Кофейная | 0,80 мг/100г | 4,00 мг/100г | 4-5500 мг/100г | 0,997 |
| р-Кумаровая | 1,2 мг/100г | 6,00 мг/100г | 6-3000 мг/100г | 0,998 |
| Феруловая | 1,80 мг/100г | 7,00 мг/100г | 7-2500 мг/100г | 0,999 |
| Цикориевая | 2,50 мг/100г | 9,00 мг/100г | 9-6600 мг/100г | 0,998 |
| Розмариновая | 2,10 мг/100г | 9,00 мг/100г | 9-8500 мг/100г | 0,998 |
Предел обнаружения метода составил 0,80 мг/100г – 2,60 мг/100г, предел количественного определения от 4,00 мг/100г до 12,00 мг/100г.
Для оценки сопоставимости и правильности методики были рассчитаны метрологические характеристики по результатам 5 параллельных измерений стандартных растворов. Относительная погрешность для большинства исследованных соединений находится в пределах от 0,89 до 4,72 % (таблица 3).
Таблица 3
Метрологическая оценка количественного определения ГКК
| № | ГКК | Х ном | Хср | S2 | S | SХср | t (,f) | х | % | ||
| 1 | 5-КХК | 50 | 51,12 | 6,817 | 2,611 | 1,168 | 0,05 | 2,78 | 2,28 | 4,48 | |
| 9500 | 9503,4 | 9266,8 | 96,26 | 43,05 | 0,05 | 2,78 | 84,37 | 0,89 | |||
| 2 | Кофейная | 35 | 34,84 | 1,573 | 1,254 | 0,561 | 0,05 | 2,78 | 1,099 | 3,16 | |
| 5000 | 4998,8 | 4897,9 | 69,98 | 31,29 | 0,05 | 2,78 | 61,34 | 1,23 | |||
| 3 | р-Кумаровая | 60 | 60,78 | 5,827 | 2,414 | 1,080 | 0,05 | 2,78 | 2,116 | 3,48 | |
| 2800 | 2806,0 | 2699,5 | 51,95 | 23,23 | 0,05 | 2,78 | 45,54 | 1,62 | |||
| 4 | Феруловая | 80 | 79,94 | 11,30 | 3,362 | 1,504 | 0,05 | 2,78 | 2,947 | 3,69 | |
| 2000 | 2013,3 | 1925,6 | 43,88 | 19,62 | 0,05 | 2,78 | 38,46 | 1,91 | |||
| 5 | Цикориевая | 45 | 50,74 | 3,193 | 1,787 | 0,799 | 0,05 | 2,78 | 1,566 | 3,09 | |
| 6300 | 6287,1 | 7255,6 | 85,18 | 38,09 | 0,05 | 2,78 | 74,66 | 1,19 | |||
| 6 | Розмариновая | 50 | 50,42 | 7,357 | 2,712 | 1,213 | 0,05 | 2,78 | 2,377 | 4,72 | |
| 8300 | 8318,2 | 9894,9 | 99,47 | 44,48 | 0,05 | 2,78 | 87,19 | 1,05 | |||
где: Х ном – истинное содержание (мг); Хср – средний результат (мг); S2 – дисперсия; S – стандартное отклонение; SХср – стандартное отклонение среднего результата; – уровень значимости; t (,f) – коэффициент Стьюдента; х – полуширина доверительного интервала; % – относительная ошибка среднего результата.
Результаты количественного определения ГКК в опытных образцах
При помощи разработанной методики был изучен состав ГКК в некоторых видах лекарственного и пищевого растительного сырья, проанализирован ряд растительных экстрактов (всего 115 объектов).
Расчет концентраций ГКК проводили методом абсолютной калибровки. Содержание кофеоиляблочной кислоты рассчитывали в пересчете на кофеоилхинную кислоту, содержание кафтаровой кислоты рассчитывалось в пересчете на кофейную кислоту, содержание диКХК рассчитывалось в пересчете на кофеоилхинную кислоту, содержание ФХК рассчитывалось в пересчете на феруловую кислоту, содержание кумароилхинной кислоты рассчитывалось в пересчете на р-кумаровую кислоту.
В результате проведенных исследований были выявлены более 35 ГКК. Была показана возможность качественного и количественного определения ГКК на фоне сложного матрикса, характерного для растительного сырья.
По итогам исследования все объекты были разделены на 3 группы:
- лекарственное и пищевое растительное сырье, которое может являться источником ГКК и в котором ГКК могут выступать в роли индикаторных компонентов (содержание от 20 мг/100 г), 61 объект (таблица 4);
- лекарственное и пищевое растительное сырье, с незначительным содержанием ГКК (содержание менее 20 мг/100г), 6 объектов (таблица 5);
- лекарственное и пищевое растительное сырье, не содержащее ГКК (содержание
менее предела обнаружения), 40 объектов.
Таблица 4
Лекарственное и пищевое растительное сырье, которое может являться источником ГКК и в котором ГКК являются индикаторными компонентами
| № | Наименование образца | Состав ГКК | Всего ГКК, % |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1 | Листья падуба парагвайского, Ilex paraguariensis | 3-КХК – 2,90%, 4-КХК – 1,79%, 5-КХК – 2,23%, сумма диКХК – 7,27% | 14,19 |
| 2 | Семена кофейного дерева сорт сантос (арабика), зеленые, Coffea arabica | 3-КХК – 0,36%, 4-КХК – 0,61%, 5-КХК – 4,30%, р-кумаровая к-та – 0,02%, ФХК – 0,03%, сумма диКХК – 0,98%, кумароилхинная к-та – 0,01 | 6,31 |
| 3 | Семена кофейного дерева сорт марагоджип (арабика), с малым содержанием кофеина, зеленые, Coffea arabica | 3-КХК – 0,38%, 4-КХК – 0,57%, 5-КХК – 3,96%, р-кумаровая к-та – 0,02%, ФХК – 0,02%, сумма диКХК – 0,98% кумароилхинная к-та – 0,01% | 5,61 |
| 4 | Листья мать-и-мачехи, Tussilago farfara | 5-КХК – 1,02%, сумма диКХК – 4,27% | 5,29 |
| 5 | Прополис, propolis | кофейная к-та – 0,82%, р-кумаровая к-та – 0,66%, феруловая к-та – 0,42%, сумма диКХК – 0,74% | 2,64 |
| 6 | Трава крапивы двудомной, Urtica dioica | 3-КХК – 0,21%, 5-КХК – 0,73%, кофеоиляблочная к-та – 1,57%. | 2,51 |
| 7 | Цветки арники горной, Arnica montana | 5-КХК – 0,32%, кофейная к-та – 0,02%, сумма диКХК – 2,08% | 2,42 |
| 8 | Плоды калины обыкновенной, Viburnum opulus | 3-КХК – 0,16%, 5-КХК – 1,84% | 2,00 |
продолжение таблицы 4
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||||
| 9 | Цветки пижмы обыкновенной, Tanacetum vulgare | 5-КХК – 0,32%, кофейная к-та – 0,02%, сумма диКХК – 1,61% | 1,95 | ||||
| 10 | Трава полыни горькой, Artemisia absinthium | 5-КХК – 0,97%, сумма диКХК – 0,88%. | 1,85 | ||||
| 11 | Цветки бузины черной, Sambucus nigra | 3-КХК – 0,10%, 5-КХК – 1,10%, р-кумаровая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,59% | 1,80 | ||||
| 12 | Листья мяты перечной, Mentha piperita | 3-КХК – 0,04%, 5-КХК – 0,13%, кофейная к-та – 0,03%, розмариновая к-та – 1,52% | 1,72 | ||||
| 13 | Листья ортосифона тычиночного, Оrthosiphon stamineus | Кафтаровая к-та – 0,09%, кофейная к-та – 0,03%, цикориевая к-та – 0,28%, розмариновая к-та – 1,15% | 1,55 | ||||
| 14 | Семена подсолнечника масляного, очищенные, Helianthus annuus | 5-КХК – 1,43%, феруловая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,08% | 1,52 | ||||
| 15 | Трава одуванчика лекарственного, Taraxacum officinale | Кафтаровая к-та – 0,22%, 5-КХК – 0,05%, кофейная к-та – 0,02%, цикориевая к-та – 1,13%, сумма диКХК – 0,08% | 1,50 | ||||
| 16 | Трава эхинацеи пурпурной, Echinacea purpurea | Кафтаровая к-та – 0,33%, 5-КХК – 0,12%, цикориевая к-та – 1,01% | 1,46 | ||||
| 17 | Трава тысячелистника обыкновенного, Achillea millefolium | 5-КХК – 0,33%, сумма диКХК – 0,75%. | 1,08 | ||||
| 18 | Корневища горца змеиного, Polygonum bistorta | 5-КХК – 0,99% | 0,99 | ||||
продолжение таблицы 4
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 19 | Цветки боярышника, Crataegus spp. | 3-КХК – 0,41%, 5-КХК – 0,55% | 0,96 |
| 20 | Трава тимьяна ползучего (чабреца), Thymus serpullum | 5-КХК – 0,05%, кофейная к-та – 0,02%, сумма диКХК – 0,17%, розмариновая к-та – 0,63% | 0,87 |
| 21 | Трава душицы обыкновенной, Origanum vulgare | кофейная к-та – 0,03%, розмариновая к-та – 0,83% | 0,86 |
| 22 | Сухой экстракт артишока, Cynara scolymus | 3-КХК – 0,15%, 4-КХК – 0,21%, 5-КХК – 0,46%, сумма диКХК – 0,04% | 0,86 |
| 23 | Плоды аниса обыкновенного, Pimpinella anisum | ФХК – 0,01%, 5-КХК – 0,46%, сумма диКХК – 0,25% | 0,72 |
| 24 | Трава хвоща полевого, Equisetum arvense | кафтаровая к-та – 0,10%, изомер кафтаровой кислоты – 0,17%, розмариновая к-та – 0,41% | 0,68 |
| 25 | Трава сушеницы топяной, Gnaphalium uliginosum | 3-КХК – 0,07%, сумма диКХК – 0,38%, розмариновая к-та – 0,11% | 0,56 |
| 26 | Листья падуба обыкновенного, Ilex aquifolium | 5-КХК – 0,21%, сумма диКХК – 0,35% | 0,56 |
| 27 | Трава копытня, Asarum europaeum | ФХК – 0,03%, 5-КХК – 0,48% | 0,51 |
| 28 | Корневища и корни девясила высокого, Inula helenium | 5-КХК – 0,14%, дикофейная к-та (в пересчете на кофейную кислоту) – 0,10%, сумма диКХК – 0,26% | 0,50 |
| 29 | Листья малины, Rubus idaeus | 5-КХК – 0,21%, кофейная к-та – 0,27%, | 0,48 |
| 30 | Трава медуницы лекарствен-ной, Pulmonaria officinalis | 5-КХК – 0,05%, кофейная к-та – 0,02%, розмариновая к-та – 0,36% | 0,43 |
продолжение таблицы 4
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 31 | Цветки бессмертника песчаного, Helichrysum arenarium | 3-КХК – 0,15%, 5-КХК – 0,02%, р-кумаровая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,25% | 0,43 |
| 32 | Плоды рябины обыкновенной, Sorbus aucuparia | 3-КХК – 0,11%, 5-КХК – 0,29% | 0,40 |
| 33 | Трава дягиля лекарственного, Archangelica officinalis | 3-КХК – 0,25%, сумма диКХК – 0,13% | 0,38 |
| 34 | Цветки ромашки аптечной, Matricaria charnomilla | 5-КХК – 0,11%, сумма диКХК – 0,21% | 0,32 |
| 35 | Цветки ноготков лекарствен-ных, Calendula officinalis | 5-КХК – 0,17%, сумма диКХК – 0,13% | 0,30 |
| 36 | Корни одуванчика лекарствен-ного, Taraxacum officinale | 5-КХК – 0,04%, цикориевая к-та – 0,21%, сумма диКХК – 0,04% | 0,29 |
| 37 | Корни лопуха большого, Arctium lappa | Феруловая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,28% | 0,29 |
| 38 | Плоды рябины черноплодной, Aronia melanocarpa | 3-КХК – 0,10%, 5-КХК – 0,17% | 0,27 |
| 39 | Корневища с корнями валерианы лекарственной, Valeriana officinalis | 5-КХК – 0,25%, кофейная к-та – 0,02% | 0,27 |
| 40 | Плоды ирги обыкновенной, Amelanchier vulgaris | 3-КХК – 0,04%, 5-КХК – 0,10%, кофейная к-та – 0,04%, р-кумаровая к-та – 0,03% | 0,21 |
| 41 | Листья березы повислой, Betula pendula | 3-КХК – 0,07%, 5-КХК – 0,13% | 0,20 |
| 42 | Плоды тмина обыкновенного, Сarum carvi | 3-КХК – 0,09%, сумма диКХК – 0,1% | 0,19 |
продолжение таблицы 4
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 43 | Трава цикория обыкновенного, Cichorium intybus | кафтаровая к-та – 0,04%, 5-КХК – 0,05%, цикориевая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,07% | 0,17 |
| 44 | Листья брусники обыкновенной, Vaccinium visit-ideae | 5-КХК – 0,17% | 0,17 |
| 45 | Плоды боярышника, Crataegus spp. | 3-КХК – 0,10%, 5-КХК – 0,04% | 0,14 |
| 46 | Трава пустырника сердечного (пятилопастного), Leonurus cardiaca | 5-КХК – 0,07%, р-кумаровая к-та – 0,05% | 0,12 |
| 47 | Плоды кориандра посевного, Coriandrum sativum | 3-КХК – 0,04%, 5-КХК – 0,03%, сумма диКХК – 0,04% | 0,11 |
| 48 | Сухой экстракт вербены, Verbena intermedia | Кафтаровая к-та – 0,09%, кофейная к-та – 0,01% | 0,10 |
| 49 | Трава зверобоя продырявлен-ного, Hypericum perforatum | ФХК – 0,02%, 5-КХК – 0,06% | 0,08 |
| 50 | Корневища цикория обык-новенного, Cichorium intybus | 5-КХК – 0,04%, цикориевая к-та – 0,01%, сумма диКХК – 0,03% | 0,08 |
| 51 | Трава череды трехраздельной, Bidens tripartita | 5-КХК – 0,07% | 0,07 |
| 52 | Почки березы повислой, Betula pendula | р-кумаровая к-та – 0,07% | 0,07 |
| 53 | Трава гречихи посевной, Fagopyrum esculentum | 5-КХК – 0,04% | 0,04 |
| 54 | Густой экстракт плодов брус-ники, Vaccinium vitis-idaea | р-кумаровая к-та – 0,03%, сумма диКХК – 0,01% | 0,04 |
продолжение таблицы 4
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 55 | Трава репешка обыкновен-ного, Agrimonia eupatoria | 3-КХК – 0,03% | 0,03 |
| 56 | Плоды черники обыкновен-ной, Vaccinium myrtillus | 5-КХК – 0,02%, р-кумаровая к-та – 0,01% | 0,03 |
| 57 | Плоды фенхеля, Foeniculum vulgare | 5-КХК – 0,03% | 0,03 |
| 58 | Листья эвкалипта прутовид-ного, Eucalyptus viminalis | Кофейная к-та – 0,02% | 0,02 |
| 59 | Побеги багульника болотного, Ledum palustre | 3-КХК – 0,02% | 0,02 |
| 60 | Корни алтея лекарственного, Althaea officinalis | р-кумаровая к-та – 0,01%, феруловая к-та – 0,01% | 0,02 |
| 61 | Сок винограда, Vitis vinifera | Кафтаровая к-та – 0,02% | 0,02 |
Таблица 5
Лекарственное и пищевое растительное сырье, с незначительным содержанием гидроксикоричных кислот (содержание менее 20 мг/100г)
| № | Наименование образца | Состав ГКК | Всего ГКК, % |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 1 | Смола ферулы камедоносной, Ferula Gummosa | Феруловая к-та – 0,01% | 0,01 |
| 2 | Плоды яблони домашней, Malus domestica | 5-КХК – 0,01% | 0,01-0,007 |
| 3 | Корневища и корни родиолы четырехчленной, Rhodiola quadrifida | Кофейная к-та – 0,01% | 0,01 |
| 4 | Корневища и корни элеутерококка колючего, Eleutherococcus senticosus | 5-КХК – 0,01% | 0,01 |
продолжение таблицы 5
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 5 | Сок вишневый, Prunus cerasus | 3-КХК – 0,005% 5-КХК – 0,001% | 0,006-0,004 |
| 6 | Сок грушевый, Pyrus communis | 5-КХК – 0,004% | 0,004-0,001 |
Растительное сырье, в котором ГКК не обнаружены: сухой экстракт лотоса, Nelumbo lutea; кора дуба черешчатого, Quercus robur; сухой экстракт бамбука, Bambusa ventricosa; почки сосны обыкновенной, Pinus sylvestris; сухой экстракт фукуса, Fucus vesiculosus; плоды укропа пахучего, Anethum graveolens; трава горца птичьего, Polygonum aviculare; плоды можжевельника обыкновенного, Juniperus communis; трава горца почечуйного, Polygonum persicaria; плоды шиповника, Rosa spp; трава горца перечного, Polygonum hydropiper; плоды ежевики, Rubus caesius; трава якорцев стелющихся, Tribulus Terrestris; корневища с корнями лапчатки белой, Potentilla alba; трава люцерны, Medicago falcago; корневища аира обыкновенного, Acorus calamus; трава донника лекарственного, Melilotus officinalis; корневища бадана толстолистного, Bergenia crassifolia; трава фиалки трехцветной, Viola tricolor; корневище ириса, Iris pallida; трава зимолюбки зонтичной, Chimaphilae herba; корневища имбиря, Zingiber officinale; трава эрвы шерстистой, Aerva lanata; корни щавеля конского, Rumex confertus; листья сенны остролистной, Cassia acutifolia; корни пиона уклоняющегося, Paeonia anomala; листья толокнянки обыкновенной, Arctostaphylos uva-ursi; корни солодки голой, Glycyrrhiza glabra; цветки липы сердцевидной, Tilia cordata; сок земляники домашней, Fragaria moschata; соплодия ольхи серой, Alnus incana; сок мандарина, Citrus reticulata; семена тыквы обыкновенной, Cucurbita pepo; сок томатный, Solanum lycopersicum; семена льна посевного, Linum usitatissimum; орех миндаля, Prunus dulcis; шишки хмеля обыкновенного, Humulus lupulus; сухой экстракт гарцинии, Garsinia cambogia; кора крушины ольховидной, Frangula alnus; корневища и корни марены красильной, Rubia tinctorum.
В ряде образцов лекарственного и пищевого растительного сырья (кора осины, Populus tremula; трава мелиссы лекарственной, Melissa officinalis; листья наперстянки пурпурной, Digitalis purpurea; листья апельсина, Citrus sinensis; листья подорожника большого, Plantago major; трава чистотела большого, Chelidonium majus; трава золототысячника зонтичного, Centaurium umbellatum; листья шалфея лекарственного, Salvia officinalis) есть компоненты по своему хроматографическому поведению и спектральным характеристикам соответствующие ГКК, структуру которых не удалось подтвердить используемыми методами. Однако можно предположить, что это производные гидроксикоричных кислот.
По составу ГКК растительное сырье можно разделить на следующие группы:
- лекарственное и пищевое растительное сырье с преимущественным содержанием производных кофейной и хинной кислоты (трава тысячелистника обыкновенного, трава полыни горькой, листья мать-и-мачехи, листья падуба парагвайского, цветки пижмы обыкновенной, цветки арники горной, цветки боярышника, цветки бузины черной, семена подсолнуха, плоды калины, плоды кофе, корневища горца змеиного, листья артишока);
- лекарственное и пищевое растительное сырье с преимущественным содержанием производных кофейной и винной кислоты (трава эхинацеи пурпурной, трава одуванчика лекарственного);
- лекарственное и пищевое растительное сырье с преимущественным содержанием розмариновой кислоты (трава чабреца, трава душицы обыкновенной, листья мяты перечной, листья ортосифона тычиночного);
крапива двудомная (единственное растение, в котором во время исследования была обнаружена кофеоиляблочная к-та);
лекарственное и пищевое растительное сырье, не содержащее гидроксикоричные кислоты (содержание менее 1,0 мг/100г).
ВЫВОДЫ
1. Изучены физико-химические свойства (растворимость, хроматографическая подвижность, УФ-спектры и масс-спектры) ГКК.
2. Разработаны методики пробоподготовки для лекарственного и пищевого растительного сырья. Изучено влияние растворителей и условий экстракции на степень извлечения ГКК из лекарственного и пищевого растительного сырья, пищевых продуктов. Подобраны оптимальные и доступные растворители для извлечения ГКК. Определено оптимальное время экстрагирования образцов.
3. Подобраны оптимальные хроматографические условия для определения хлорогеновой, неохлорогеновой, криптохлорогеновой, кафтаровой, кофейной, р-кумаровой, феруловой, цикориевой, дикофеоилхинных, дикофейной, ферулоилхинных кислот. Разработана методика ВЭЖХ - анализа для количественного определения ГКК в лекарственном и пищевом растительном сырье, пищевых продуктах.
4. Методика показала хорошую эффективность, высокую степень разделения и селективность. Определены параметры пригодности хроматографической системы, проведена валидация методики.
5. Выделено лекарственное и пищевое растительное сырье, которое может являться источником ГКК и в котором ГКК могут выступать в роли индикаторных компонентов. Выявлено лекарственное и пищевое растительное сырье, содержащее незначительное количество ГКК, а так же не содержащее ГКК.
6. С помощью разработанной методики ВЭЖХ анализа было проанализировано 115 образцов растительного сырья, экстрактов, пищевых продуктов, в том числе поступающих на экспертизу в НИИ питания РАМН, что позволило стандартизовать продукт, оценить его качество и уровень содержания биологически активных веществ. Использование разработанных методик позволяет обнаруживать и характеризовать новые источники ГКК и выделять растения с различным их содержанием.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Medvedev Y.V., Eller K.I. Determination of hydroxycinnamic acids in plant extracts and food supplements // Сборник трудов 12-го Международного конгресса Phytopharm. – СПб.: - 2008. – С. 74.
2. Медведев Ю.В., Передеряев О.И. Определение гидроксикоричных кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Материалы конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». – М.: - 2009. – С. 110.
3. Медведев Ю.В., Передеряев О.И., Прокофьева В.И. Изучение качественного состава гидроксикоричных кислот в кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектированием // Тезисы докладов межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». – СПб.: - 2009. – С. 43.
4. Медведев Ю.В., Богачук М.Н., Передеряев О.И. Определение кафтаровой, хлорогеновой, цикориевой, феруловой кислот в кофе, фенхеле, артишоке, эхинацее пурпурной методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Материалы ежегодной конференции молодых ученых НИИ питания РАМН // Вопросы детской диетологии. – 2009. т.7. - №4. С. 63–64.
5. Медведев Ю.В., Богачук М.Н., Передеряев О.И. Изучение состава гидроксикоричных кислот в растительном сырье и биологически активных добавках к пище на их основе // Сборник материалов XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». – М.: 2009. – С. 100.
6. Медведев Ю.В., Богачук М.Н., Эллер К.И., Прокофьева В.И. Разработка методики идентификации и количественного определения гидроксикоричных кислот // Сборник материалов XI Всероссийского Конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье». – М.: 2009. – С. 101.
7. Медведев Ю.В., Передеряев О.И., Арзамасцев А.П., Эллер К.И., Прокофьева В.И. Определение гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье и объектах растительного происхождения // Журнал Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2010. - №3 – С. 25-31.
8. Медведев Ю.В. Изучение состава гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье методом ВЭЖХ-МС // Сборник материалов XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». – М.: 2010. – С. 677.
«