WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Исследование золпидема в химико-токсикологическом отношении


На правах рукописи

ЕГОРОВА ЕЛЕНА ИВАНОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗОЛПИДЕМА В химико-токсикологическом отношении


14.04.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Хомов Юрий Александрович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Ярыгина Татьяна Ивановна,

ГОУ ВПО «Пермская государственная

фармацевтическая академия Росздрава»

кандидат фармацевтических наук, доцент

Захарова Людмила Андреевна,

Управляющая компания «Медисорб Групп»,

г. Пермь

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Первый Московский

государственный медицинский университет

им. И.М. Сеченова Министерства

здравоохранения и социального развития РФ»

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.068.01 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Полевая, д. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государственной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, д.46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА http://pfa.ru «15» апреля 2011 г.

Автореферат разослан «15» апреля 2011 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.А. Липатникова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема нарушений сна (инсомния) продолжает сохранять свое медицинское и социальное значение. Расстройства, вызванные инсомнией, лидируют по распространенности и влиянию на жизнедеятельность человека.

Некоторые авторы считают, что нарушениями сна страдает почти половина населения планеты. Поэтому снотворные средства (гипнотики) и способы лечения инсомний являются предметом постоянного внимания специалистов и врачей.

Появление нового третьего поколения снотворных препаратов, в том числе производных имидазопиридина, стало значительным шагом в лечении инсомний. Одним из главных представителей этого класса является золпидем, который широко и эффективно используется в медицинской практике за рубежом, а в последние годы и в России.

Препарат хорошо переносится, но в связи с нежелательными побочными явлениями со стороны центральной нервной системы (спутанность сознания, галлюцинации, эйфория, нарушение координации движений, антероградная амнезия), может быть использован в немедицинских целях. Побочные явления проявляются особенно сильно при превышении доз.

При одновременном применении с препаратами с угнетающим действием на ЦНС (другие снотворнные, седативные, антигистаминные средства, алкоголь) происходит взаимное усиление действия, что является причиной интоксикаций различной степени тяжести. При передозировке и длительном применении вызывает зависимость и привыкание. Известны случаи острых и смертельных отравлений.

В связи с этим золпидем имеет токсикологическое значение. Для своевременной и объективной диагностики интоксикаций, учитывая нехарактерность клинической картины, особое значение приобретают результаты химического анализа.

Критический обзор доступной литературы показал, что фармакологическому и клиническому изучению золпидема посвящена значительная часть литературы, информация же о его химико-токсикологическом анализе недостаточна. Все названное делает актуальным разработку методик выделения золпидема, идентификации и количественного определения его из биологических жидкостей и субстратов для целей клинической лабораторной диагностики и химико-токсикологического анализа при злоупотреблениях и экспертизе отравлений.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы является исследование по разработке и оптимизации методик изолирования, обнаружения и количественного определения золпидема для нужд его химико-токсикологического анализа.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  • Теоретически прогнозировать и экспериментально подтвердить оптимальные условия изолирования золпидема и применить полученные данные для разработки методик выделения его из биологических объектов.
  • Предложить эффективные способы очистки золпидема, выделенного из биологических объектов.
  • Провести изучение хроматографического поведения золпидема на различных сорбентах и в различных системах растворителей ВЭТСХ с целью введения в ХТС скрининг.
  • Исследовать возможности идентификации золпидема в извлечениях из биосубстратов с помощью химических и современных инструментальных методов.
  • Разработать чувствительные методики количественного определения золпидема с применением УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и газовой хроматографии – масс-спектрометрии.
  • Изучить пригодность разработанных методик обнаружения и определения для химико-токсикологического анализа золпидема.

Научная новизна. Впервые разработана научно-обоснованная методология химико-токсикологического анализа биологических объектов при интоксикациях золпидемом.

Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность прогнозирования оптимальных условий экстрагирования золпидема в зависимости от рКа, рН среды и природы органического растворителя.

Изучены хроматографические параметры золпидема на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Merck, Силуфол и разработаны условия его обнаружения при ХТС. Установлено, что золпидем укладывается в условия ХТС скрининга лекарственных соединений, имеющих токсикологическое значение.

Разработаны методики идентификации золпидема на основе реакций окрашивания и методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, ГХ/МС, ИК и УФспектроскопии.

Изучены спектральные характеристики золпидема в различных растворителях, разработаны методики его количественного определения на основе УФ-спектрофотометрии, ВЭЖХ, ГХ/МС и приведены параметры валидационной оценки.

Разработаны схемы химико-токсикологического анализа биологических объектов при диагностике интоксикаций золпидемом.

Установлено влияние процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Разработанные методики пробоподготовки, изолирования, очистки извлечений, обнаружения и количественного определения золпидема рекомендованы для использования в химико-токсикологических лабораториях для аналитической диагностики отравлений, а также в учебном процессе на кафедрах токсикологической и фармацевтической химии фармацевтических ВУЗов.

По результатам исследований подготовлен проект информационного письма «Химико-токсикологический анализ золпидема в биологических жидкостях».

Методики химико-токсикологического анализа золпидема внедрены в практику работы судебно-химического отделения ГУЗОТ Краевого Бюро судебно-медицинской экспертизы, г. Пермь; СХО Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Бурятия, г. Улан-Удэ; СХО ГУ Бюро судебно-медицинской экспертизы Минздрава Республики Марий-Эл, г. Йошкар-Ола; Государственного клинического лечебно-профилактического учреждения «Бюро судебно-медицинской экспертизы», г. Киров; а также в учебный процесс на занятиях интернов-аналитиков на кафедре фармацевтической химии ФДПО и ФЗО и токсикологической химии Пермской государственной фармацевтической академии.

Разработанные методики включены в практику судебно-медицинских и химико-токсикологических лабораторий через постоянно действующие курсы специализации и усовершенствования врачей-лаборантов и врачей судебно-медицинских экспертов в региональном учебно-методическом центре аналитической диагностики наличия наркотических средств, психотропных и других токсических веществ Пермской государственной фармацевтической академии (2006-2009 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 11 статей, из которых - 2 в изданиях перечня ВАК.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены с опубликованием на 2-nd Russian - Chinese international scientific conferences on pharmacology (Perm, 26-27 October 2006); на научно-практической конференции «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», Ростов-на-Дону, 16-17 октября 2006 г.; на XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (апрель 2007, 2008 гг., Москва); на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию ПГФА «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств» (27-28 ноября 2007 г., Пермь); на научно-практической конференции «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения» (25-26 апреля 2008 г., Санкт-Петербург); на Российской научно-практической конференции ПГФА, проводимой в рамках 14-ой международной выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь); на Межвузовской научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений», посвященной 90-летию СПХФА (23-24 апреля 2009 г., Санкт-Петербург); на X Международном научном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Инновационные технологии в биологии и медицине», посвященном 50-летнему юбилею РУДН, Москва, 9-12 декабря 2009 г.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Росздрава». Номер государственной регистрации 01.9.50 007417. Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета протокол №4 от 28.12.2006г.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 26 рисунков. Работа состоит из введения, 5 глав, выводов, списка литературы, включающего 170 источников, из них 82 — на иностранных языках, и приложения.

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, приведены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе (обзор литературы) представлены общие сведения о золпидеме и способы его анализа.

В главе 2 дано краткое описание объектов и методов исследования.

В 3 главе представлены способы обнаружения и определения золпидема на основе методов ВЭЖХ, вариантов НФ- и ОФ- ХТС, ИК-, УФ-спектроскопии, ГХ, ГХ/МС.

4 глава посвящена изолированию, обнаружению и определению золпидема в трупном материале.

В 5 главе показана применимость разработанных методик для анализа биологических жидкостей, в том числе образцов реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема) методами ХТС, УФ-спектроскопии, ВЭЖХ и ГХ/МС. Представлены параметры валидационной оценки методик определения. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения проб. Составлена схема химико-токсикологического анализа золпидема в биологических жидкостях.


Положения, выносимые на защиту:

1. Теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение оптимальных условий изолирования золпидема из биологических объектов в зависимости от показателя ионизации, рН среды и природы органического растворителя.

2. Результаты экспериментальных исследований по разработке реакций окрашивания, ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопии и ГХ/МС. УФ-спектрофотометрическая, ВЭЖХ и ГХ/МС методики количественного определения золпидема, разработанные применительно к анализу биологических сред.

3. Данные по выяснению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках хранения.

4. Схема и общий методологический подход к химико-токсикологическому исследованию биологических субстратов при интоксикациях золпидемом.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


  1. Способы обнаружения и количественного определения золпидема

При исследовании избрано направление комплексного использования современных физико-химических методов в сочетании с традиционными химическими реакциями с целью выявления наиболее чувствительных и специфичных к задачам химико-токсикологического анализа золпидема.

МКС и реакции окрашивания

Для обнаружения золпидема было изучено отношение его к 20 осадительным реактивам. Со многими (12 из 20) из исследованных реактивов золпидем дает аморфные осадки. Наиболее чувствительными являются реакции с реактивами Драгендорфа (0,57 мкг вещества в пробе) и золотохлористоводородной кислотой (0,50 мкг). Осадков с кристаллическим строением не наблюдалось ни с одним из примененных реактивов.

Далее изучалась возможность применения для обнаружения золпидема реакций окрашивания. Исследовано отношение к 10 реактивам (концентрированные азотная, серная, хлористоводородная кислоты, реактивы Марки, Фреде, Манделина, Эрдмана и др.).

Наиболее чувствительной является реакции с реактивом Марки, (наблюдается красно-оранжевое окрашивание, открываемый минимум – 13 мкг). Реакция была использована в дальнейшем для обнаружения зон локализации золпидема при ХТС. Предел обнаружения золпидема предлагаемой реакцией в хлороформных извлечениях, полученных при изолировании из биологического материала, составляет в моче - 0,22 мг, в печени - 0,30 мг.


Хроматография в тонком слое сорбента

Далее исследована возможность доказательства золпидема методом хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках ВЭТСХ, Сорбфил, Силуфол, Merck в нормально-фазном варианте и обращено-фазном варианте на пластинках плазмахром с привитой фазой С3 в индивидуальных растворителях и различных системах комбинированных растворителей, применяемых при ХТА лекарственных и наркотических веществ.

Для детектирования зон локализации золпидема на хроматограмме использовали:

- визуальное наблюдение пластинки в фильтрованном УФ-свете при 254 и 365 нм. При 254 нм (поглощение) наблюдали темно-фиолетовые пятна (предел обнаружения - 0,30 мкг); при 365 нм (свечение) наблюдали пятна, проявляющиеся в виде сиреневой флюоресценции (предел обнаружения - 0,18 мкг);

- обработку реактивом общегруппового назначения - реактивом Драгендорфа по Молдаверу (коричневато-оранжевые пятна, предел обнаружения - 0,35 мкг);

- обработку наиболее специфичным реагентом - реактивом Марки (капельно, наблюдается красно-оранжевое окрашивание, предел обнаружения - 7,0 мкг).

Установлено, что в НФ варианте в исследованных 11 индивидуальных растворителях золпидем не обладает достаточной хроматографической подвижностью, оставаясь в основном вблизи стартовой линии.

При исследовании в комбинированных системах растворителей хроматографическая подвижность золпидема на пластинках ВЭТСХ проявляется в интервале Rf от 0,38 до 0,77 при значении 0,64 в общей универсальной скрининговой системе толуол – ацетон – этанол – 25% раствор аммиака 45:45:7,5:2,5 и скрининговой для азотсодержащих соединений основного характера системе диоксан – хлороформ – ацетон – 25% раствор аммиака 47,5:45:5:2,5 (Rf 0,67), которые были избраны нами в качестве базовых для ХТА золпидема в биологических объектах.

Системы хлороформ - 25% раствор аммиака 25:15 и этилацетат-метанол - 25% раствор аммиака 17:2:1 можно считать оптимальными (Rf 0,54 и 0,38 соответственно) для золпидема и могут быть использованы при направленном анализе в качестве подтверждающих.

В обращенно-фазном варианте использовали водно-спиртовые смеси. Детектирование золпидема проводили теми же способами, что и в нормально-фазном варианте. В общей системе растворителей этанол – вода – 25% раствор аммиака 6:5,5:0,5 Rf золпидема 0,56. При подтверждающем исследовании в частных системах, отличающихся соотношением полярных компонентов, величина Rf золпидема колеблется от 0,39 до 0,69. Из частных систем при ОФ наиболее оптимальна для золпидема система этанол – вода – 25% раствор аммиака 8:1:0,5 (Rf 0,61).

Четкие пятна и аналогичные значения Rf наблюдались в обоих вариантах на каждом виде сорбента как в зоне метчика, так и в зонах хроматографирования исследуемых извлечений.





Исследование золпидема методом ГХ/МС


Исследование золпидема методом газовой хроматографии масс-спектрометрии проведено на газовом хроматографе, оборудованном кварцевой капиллярной колонкой с неполярной неподвижной фазой. Для обнаружения использован масс-селективный детектор (МСД).

Условия хроматографического разделения: хроматограф Agilent 6850; газохроматографическая колонка капиллярная НР-5МS с внутренним диаметром 0,25 мм, длиной 30 м; МСД Agilent 5973N. Газноситель гелий. Скорость потока газа-носителя 1,5 мл/мин. Температура инжектора и интерфейса 250°С и 280°С соответственно. Температура колонки – градиент 70°С (2 мин) — 280°С, скорость программирования 20°С в минуту. Ввод пробы ручной, без деления потока газа-носителя. Объем пробы 1 мкл в спирте этиловом при концентрации в растворе 100 нг/мл. МСД работает в режиме электронного удара при 70 эВ.

Получена хроматограмма (время удерживания золпидема 9,65 мин), проведена регистрация масс-спектров в режиме полного сканирования от 45 до 450 аем. Данные представлены на рисунках 1,2. Характеристические ионы при выделении фрагментограммы, со временем удерживания 9,65 мин — 235, 307, 219, 92 m/z (масс/заряд). Данные приведены в порядке уменьшения m/z. При сравнении с масс-спектрами библиотек совпадение времени удерживания и масс-спектра составляет 98%.

Рисунок 1 - Хроматограмма золпидема ГХ/МС

Рисунок 2 – Масс - спектр золпидема

Количественное ГХ/МС определение проводили в тех же условиях, применяя метод внутреннего стандарта (метиловый эфир налидиксовой кислоты).

Режим регистрации — селективный ионный мониторинг по ионам m/z 235, 307, 219 (золпидем) и 188, 215, 246 (внутренний стандарт). Калибровочный график был получен, исходя из соотношений площадей пиков наиболее интенсивных ионных фрагментов, т.е. ионов с величинами m/z 235 (золпидем) и 188 (внутренний стандарт). График линеен в интервале концентраций 0,1–10 мг/л. Предел обнаружения — 10 нг/мл. Предел количественного определения — 25 нг/мл.

Метод ГХ/МС был использован для качественного и количественного определения золпидема в моче.


УФ-спектрофотометрия

Для определения золпидема как соединения, имеющего в своей структуре хромофорные группы, исследована возможность использования метода УФ-спектрофотометрии.

Для снятия спектров готовили стандартные растворы золпидема в соответствующем растворителе с содержанием 18 мкг/мл. Спектры снимались на Specord-40-M в 1 см кюветах в интервале длин волн 220330 нм. Раствором сравнения служил соответствующий растворитель. В качестве растворителей использовали воду, 0,1М раствор кислоты хлористоводородной, спирты этиловый и метиловый, хлороформ.

Анализ электронных спектров в различных полярных и аполярных растворителях показал, что золпидем имеет УФспектры, характеризующиеся одной полосой поглощения с двумя максимумами для воды, 0,1М раствора кислоты хлористоводородной и спирта метилового (см. рис. 3).

Рисунок 3 - Спектры поглощения золпидема в воде, спирте метиловом и 0,1М растворе кислоты хлористоводородной

Наличие ярко выраженного максимума абсорбции золпидема в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм (а также в связи с тем, что раствор хлористоводородной кислоты предполагалось далее применять в качестве элюента золпидема с хроматограммы), позволило нам использовать собственное поглощение вещества в разработке спектрофото­метрической методики его количественного определения.

Подчинение основному закону светопоглощения при 295 нм наблюдается в интервалах концентраций золпидема от 4 до 32 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9996. Удельный показатель 480. Чувствительность определения 0,21 мкг/мл.

Методика УФ-спектрофотометрического анализа была использована для изучения степени экстрагируемости золпидема органическими растворителями в зависимости от рН среды и для количественного определения золпидема, выделенного из биологических объектов, в том числе из образцов реальной мочи после принятия терапевтических доз.

Метод ВЭЖХ

Метод ВЭЖХ применен нами для идентификации и количественного определения золпидема в обращенно-фазном варианте на основе приборного комплекса «Милихром А-02» с УФдетектором.

Для решения поставленной задачи использовалась стальная хроматографическая колонка диаметром 2 мм, длиной 75 мм, заполненная обращенно­фазным сорбентом марки Силасорб 1005С18, размер частиц 5 мкм.

При экспериментальной проверке в качестве подвижной фазы избрана смесь состава ацетонитрил-вода в соотношении 65:35 при рН 3 (добавление концентрированной фосфорной кислоты); скорость потока элюента 75 мкл/мин. Для выбора длины волны детектирования был снят спектр золпидема в подвижной фазе в диапазоне длин волн от 190 до 360 нм.

УФ-спектр золпидема в подвижной фазе (см. рис. 4) характеризуется одной полосой поглощения с тремя максимумами (205, 240 и 297 нм) и двумя минимумами (227 и 260 нм). Максимум при 240 нм избран в качестве аналитической длины волны.

Идентификация золпидема строилась на определении хроматографического параметра абсолютного времени удерживания tr — эта величина является характеристикой вещества в данной хроматографической системе и спектральных соотношений D — которые рассчитывали в режиме двухволновой детекции при 240/300 нм с опорной длиной волны 240 нм. Кроме того, идентификацию проводили по спектру поглощения в интервале длин волн 190-360 нм.

Рисунок 4 – УФ-спектр стандартного раствора золпидема в элюенте

Для определения времени удерживания золпидема снимали хроматограммы стандартного раствора 1 мг/мл в подвижной фазе при неизменных условиях:

  • подвижная фаза: ацетонитрил – вода 65:35, рН 3;
  • температура термостата колонки 35С;
  • постоянная времени детекции – 0,34 сек;
  • постоянная скорость потока элюента – 75 мкл/мин;
  • объем образца, взятого для анализа – 5 мкл.

В данных хроматографических условиях время удерживания золпидема составляет 2,80±0,014 мин (см. рис. 5), спектральное соотношение 240/300 – 0,538.

Для количественного определения золпидема методом ВЭЖХ использовали метод абсолютной калибровки. Линейная зависимость площади хроматографического пика от концентрации золпидема наблюдалась в интервале от 6,5 до 130 мкг/мл. Коэффициент корреляции составил 0,9998. Расчетная чувствительность обнаружения составила 31 нг/мл.

Рисунок 5 - Хроматограмма стандартного раствора золпидема

Метод ВЭЖХ был использован для качественного и количественного определения золпидема в биологических жидкостях.


2. Изолирование из биологических объектов

Для решения вопроса максимального изолирования соединения из объектов анализа важен процесс прогнозирования оптимальных условий его экстракции, который зависит от ряда факторов: показателя ионизации, коэффициента распределения и др.

По литературным данным рКа золпидема составляет 6,2, что подтверждает основные свойства соединения; log P  3,85, что показывает наличие у соединения гидрофильных свойств.

При расчете степени ионизации золпидема в процентах при различных значениях рН (данные представлены в таблице 1) установлено, что при рН 1–2 исследуемое соединение полностью ионизировано. Начиная с рН 3, появляется его молекулярная форма, которая достигает 100% при рН 10. Поэтому сделано предположение, что при химико-токсикологических анализах максимальная экстракция золпидема органическими растворителями из водных извлечений должна достигаться при рН 9–10. Степень ионизации золпидема при данных рН минимальна. Однако, в связи с лабильностью соединения в щелочной среде (наличие амидной группировки) следует предполагать как наиболее оптимальное значение рН среды 8.

Таблица 1 - Степень ионизации золпидема при заданных значениях рН

рН рН – рКа Концентрация катионной формы, %
1 -5,2 В области рН 1–2 золпидем полностью ионизирован
2 -4,2
3 -3,2 99,94
4 -2,2 99,37
5 -1,2 94,06
6 -0,2 61,31
7 0,8 13,68
8 1,8 1,56
9 2,8 0,16
10 3,8 0,02
11 4,8 В области рН 11–14 золпидем полностью неионизирован
12 5,8
13 6,8
14 7,8

Далее нами было проведено экспериментальное подтверждение предположений экстрагируемости золпидема в зависимости от рН среды различными органическими растворителями: хлороформ, метиленхлорид, эфир (как наиболее часто используемые в практике химико-токсикологических анализов). Растворители, имеющие величину диэлектрической проницаемости большую, чем у хлороформа, не исследовались в связи с их значительной смешиваемостью с водой.

Установлено, что золпидем экстрагируется органическими растворителями, достигая максимума экстракции хлороформом 99,50%, метиленхлоридом 99,85%, эфиром 98,43% при рН 8.

Таким образом, как показали экспериментальные данные, хлороформ может служить оптимальным экстрагентом для изолирования золпидема из биологических объектов в общей схеме изолирования при ненаправленных химико-токсикологических анализах. При направленных исследованиях в качестве оптимального экстрагента для золпидема могут быть использованы, кроме хлороформа, метиленхлорид или эфир.

Полученные результаты послужили основой для разработки методик определения золпидема в биосубстратах. Нами использовались приемы экстракции водой, подкисленной щавелевой кислотой при изолировании золпидема из трупного материала. Из крови и мочи изолирование проводили прямой дробной экстракцией метиленхлоридом (хлороформом) при рН 8.


3. Очистка и определение золпидема при химико-токсикологических исследованиях

Вопросы очистки золпидема от сопутствующих балластных веществ предполагалось решать использованием приемов центрифугирования, фильтрования через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом и хроматографической очистки в тонких фиксированных слоях сорбента.

Хроматографический прием позволил сочетать очистку с предварительной идентификацией и делать последующее обнаружение и количественное определение специфичным.

При решении вопроса о возможности использования разработанных методик в практике ХТА для определения золпидема доказано, что балластные вещества не оказывают заметного влияния на определение и оптическая плотность экстрактов, полученных из контрольных проб, не содержащих золпидем, практически равна нулю.

Разработанные методики при УФ-спектрофотометрическом определении золпидема применены для исследования биологического материала. Анализу подвергались хлороформные экстракты, полученные из щелочного раствора в аликвотах 1/5-1/2 часть от извлечения при затравке 0,5 и 1 мг на 25 гр. печени.

Результаты количественного определения золпидема, изолированного из биосубстрата представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты количественного определения золпидема в печени

Добавлено, мг Найдено, в % Метрологические характеристики
0,5 76,82 70,57 67,19 68,01 75,52 = 71,62 S = 4,36 S= 1,95 = 5,42 Е = 7,57
1 78,32 76,24 69,18 81,46 79,59 = 76,96 S = 4,75 S= 2,12 = 5,89 Е = 7,65

Как видно из данных таблицы 2, предложенная методика изолирования и определения позволяет выделить в среднем 71,62% и 76,96% золпидема из 25 г органа (ткань печени) при содержании в нем 0,5 и 1 мг анализируемого вещества при относительной ошибке определения 7,57% и 7,65% соответственно.

При исследовании биологических жидкостей УФ-спектрофотометрическое определение проводили в аликвоте 1/5-1/2 часть при затравке 0,25 мг на 15 мл мочи или 5 мл плазмы.

При исследовании биологических жидкостей методом ВЭЖХ определение проводили при затравке 0,1 мг на 2 мл мочи или 2 мл плазмы. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 – Результаты количественного определения золпидема в моче и плазме

Добавлено золпидема,в мг Найдено золпидема в % Метрологи-ческие характерис-тики Добавлено золпидема,в мг Найдено золпидемав % Метрологи-ческие характерис-тики
При УФ-спектрофотометрии
На 15 мл мочи На 5 мл плазмы
0,25 89,92 = 94,11 S = 2,97 S = 1,33 = 3,70 Е=3,93 0,25 76,80 = 78,73 S = 2,60 S = 1,16 = 3,22 Е= 4,09
0,25 95,08 0,25 82,40
0,25 96,85 0,25 80,08
0,25 92,12 0,25 78,45
0,25 96,50 0,25 75,92
При ВЭЖХ-определении
На 2 мл мочи На 2 мл плазмы
0,1 94,06 = 96,40 S = 2,97 S = 1,33 = 3,70 Е = 3,84 0,1 74,87 =76,39 S = 1,82 S = 0,81 = 2,25 Е = 2,95
0,1 96,73 0,1 77,48
0,1 92,73 0,1 77,70
0,1 99,00 0,1 73,99
0,1 99,49 0,1 77,90

Разработаны унифицированные методики определения золпидема в биологических жидкостях на основе дробной экстракции метиленхлоридом и хроматографии в тонком слое сорбента, УФспектрофотометрии, ВЭЖХ. Методика позволяет определять при УФ-спектрофотометрии: в моче (15 мл) — 89,92-96,85% золпидема; в плазме (5 мл) — 75,92-82,40%. При ВЭЖХ определении (2 мл мочи) — 92,73- 99,49%, в плазме (2 мл) – 73,99-77,90%.

Установлена валидность методик определения золпидема по показателям линейность, специфичность, предел обнаружения и определения, сходимость и правильность полученных результатов, при ВЭЖХ показана пригодность хроматографической системы.

4. Исследование образцов реальной мочи после принятия терапевтических доз золпидема

Далее была показана применимость разработанных методик для доказательства и определения золпидема в образцах реальной мочи после принятия терапевтических доз препарата (1 таблетка с содержанием золпидема 10 мг). Изолирование проводили прямой дробной экстракцией метиленхлоридом при рН 8. Аликвоты извлечений из щелочного раствора после их концентрирования исследовали хроматографически в тонком слое сорбента (Merck).

А  —  метчик золпидема (стандартный раствор 1 мг/мл)

Б  —  1/10 часть извлечения для предварительного хроматографического теста

В  —  1/2 часть извлечения для УФ-спектрофотометрического исследования

А Б В

Рисунок 6 - Хроматограмма золпидема, выделенного из мочи
после принятия терапевтической дозы

Rf золпидема, выделенного из образцов реальной мочи, четко соответствует Rf внешнего и внутреннего стандартов ( 0,64).

При анализе образцов реальной мочи помимо золпидема на хроматограммах (см. рис. 6) в исследованных извлечениях обнаруживаются дополнительно 3-4 пятна с меньшей хроматографической подвижностью (вблизи стартовой линии). С известной степенью вероятности появление некоторых из них можно отнести за счет продуктов биотрансформации золпидема в организме человека.

Количественное определение терапевтических уровней золпидема в реальной моче методом УФ-спектрофотометрии проводили после ХТС выделения и элюирования с хроматограммы 0,1М раствором хлористоводородной кислоты (5 мл).

Спектр золпидема, выделенный из реальной мочи после принятия терапевтической дозы, был идентичен спектру стандартного раствора вещества.

Присутствие золпидема в реальной моче подтверждено также методами ВЭЖХ и ГХ/МС. (Вариант хромато-масс-спектрометрии был использован для исследования золпидема в образцах реальной мочи после выделения ТФЭ).

При изучении влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения проб показано, что золпидем сохраняется в незаконсервированной моче при замораживании проб в холодильнике не менее 12 месяцев. При замораживании проб снижение концентрации составляет до 26% через 1 год. При хранении при +4°С сохраняется до 78% через 2 месяца, при этом наблюдается смещение рН среды до 10-11, что может приводить к щелочному гидролизу и частичной деструкции определяемого вещества. В условиях хранения при комнатной температуре золпидем не обнаруживается уже через 3 месяца при смещении рН образцов мочи до 11-12, что ведет к разрушению лабильного определяемого вещества.

На основании проведенных экспериментальных исследований нами предложены схемы анализа золпидема, применяемых для химико-токсикологических целей.


Схема химико-токсикологического анализа трупного материала на золпидем

Объект исследования, печень 25 г

Настаивание с водой 1:2; 2 часа

рН 2 (Н2С2О4)

Центрифугирование 2,5 тыс. об/мин, 20 минут

Водное извлечение (центрифугат)

25% раствор NH4OH, рН 8

Хлороформ – 3 раза по 10, 10, 5 мл по 10 минут на электровстряхивателе

Хлороформный экстракт

Безводный Na2SO4 (фильтрация через стеклянный фильтр)

1/2 часть 1/2 часть

Обнаружение: Количественное определение:

ХТС УФ-спектрофотометрия

Реакции окрашивания

УФ-спектр, ВЭЖХ

ГХ, ГХ/МС


Рисунок 7 - Схема химико-токсикологического анализа трупного материала на золпидем






Схема химико-токсикологического анализа на золпидем в биологических жидкостях

Моча (15-30 мл для УФ, Кровь (5 мл для УФ,

по 2 мл для ВЭЖХ и ГХ/МС) 2 мл для ВЭЖХ)

Трехкратное разбавление водой

   25% раствор NH4OH, рН 8-9

Экстрагирование метиленхлоридом (хлороформом)

Органическая фаза

Фильтрование через мелкопористый стеклянный фильтр с б/в Na2SO4

часть часть

Обнаружение: Количественное определение

ХТС, УФ-спектр

Реакции окрашивания ВЭЖХ-УФ ГХ/МС УФ-СФМ ВЭЖХ, ГХ/МС (моча, кровь) (моча) (моча, кровь)

Рисунок 8 - Схема химико-токсикологического анализа на золпидем в биологических жидкостях

ВЫВОДЫ

1. Исследовано отношение золпидема к осадительным реактивам. В 12 из 20 реакций наблюдались аморфные осадки. Наиболее чувствительной является реакция с реактивом Драгендорфа — 0,57 мкг вещества в пробе. При исследовании реакций окрашивания наиболее чувствительной оказалась реакция с реактивом Марки — 13,0 мкг.

2. Проведено углубленное изучение хроматографического поведения золпидема методом ВЭТСХ. Избраны системы растворителей для последующего их использования при ХТА биологических объектов на золпидем. Избраны способы и реакции детектирования золпидема. Определена чувствительность каждого детектирующего реагента. Показано, что при ХТС исследовании золпидем легко идентифицируется по величине Rf, красно-оранжевому окрашиванию с реактивом Марки и собственной сиреневой флуоресценции в УФ-свете при 365 нм.

3. Установлена возможность использования методов УФ-, ИК-спектроскопии, ВЭЖХ, ГХ, ГХ/МС для доказательства золпидема.

4. Разработана методика количественного определения золпидема УФспектрофотометрией в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты при 295 нм. Определены параметры количественной оценки золпидема методом абсолютной калибровки ВЭЖХ на приборном комплексе «Милихром А-02». ГХ/МС количественное определение проведено методом внутреннего стандарта по наиболее важному ионному фрагменту золпидема 235 m/z.

5. Теоретически прогнозированы и экспериментально подтверждены оптимальные условия выделения золпидема с учетом pKa и рН среды. Показано, что оптимальными экстрагентами для золпидема при ЖЖЭ следует считать метиленхлорид, хлороформ, эфир при рН 8-9.

6. Разработаны условия очистки от соэкстрактивных балластных веществ при ХТА золпидема, заключающиеся в сочетании ХТС с центрифугированием и обязательной фильтрацией аналита через мелкопористый стеклянный фильтр с безводным натрия сульфатом.

7. Высокая чувствительность используемых методов анализа позволила значительно сократить количество исследуемого объекта (особенно при ВЭЖХ и ГХ/МС), минимизировать и оптимизировать процесс пробоподготовки, максимально снизить влияние соэкстрактивных веществ.

8. Продемонстрирована возможность применения разработанных методик для выделения золпидема из биосубстрата (ткань печени) до 71-76% из 25 г органа при содержании в нем 0,5 и 1 мг анализируемого вещества; до 78,73% из 5 мл плазмы крови; до 94,11% из 15 мл мочи при содержании в обоих случаях по 0,25 мг золпидема в пробе. Показана применимость разработанных методик для анализа реальной мочи (после принятия терапевтических доз золпидема - 10,0 мг). Представлены параметры валидационной оценки методик определения.

9. Проведено исследование по изучению влияния процессов биодеградации на определение золпидема в моче при различных сроках и условиях хранения. Установлено, что замораживание проб мочи позволяет продлить сроки хранения объекта для анализа на золпидем до 1 года.

10. Составлены схемы химико-токсикологического анализа на золпидем в трупном материале и биологических жидкостях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Khomov, Yu. Zolpidem: means of identification under chemical-toxicological analysis / Yu. Khomov, N. Kokcharova, E. Panteleeva, M. Dayech // Fundamental pharmacology and pharmacy - clinical practice / Materials of the 2-nd Russian-Сhinese international scientific conferences on pharmacology, Perm. – 2006. – P.170-171.

2. Хомов, Ю.А. Варианты высокоэффективной тонкослойной хроматографии в анализе золпидема / Ю.А. Хомов, Н.В. Кокшарова, Е.И. Пантелеева // «Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)», 16-17 октября 2006 г.: материалы … – Ростов-на-Дону: изд-во ЮНЦ РАН, - 2006. – С. 101.

3. Определение золпидема в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Ю.А. Хомов, Е.И. Пантелеева, Ю.Н. Карпенко, Н.В. Кокшарова // Человек и лекарство: тез. докл. XIV Рос. нац. конгр. Москва, апрель 2007. – М., 2007. - С. 786.

4. Исследования по обнаружению золпидема при химико-токсикологических анализах / Ю.А. Хомов, Е.И. Пантелеева, Н.В. Кокшарова, М.В. Сединина // Вестник ПГФА. Научн.-практич. журнал. г. Пермь. – 2007. – №2 – С. 187-190.

4. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в анализе золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Ю.Н. Карпенко, Н.В. Кокшарова, М.В. Сединина // «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств». Рос. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г., Пермь): материалы … – Пермь, 2007. – С. 222-227.

5. Исследование экстракции золпидема из водных растворов / Е.А. Шилова, С.С. Катаев, Н.Б. Зеленина, Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // «Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств». Рос. науч.- практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА (27-28 ноября 2007 г., Пермь): материалы … – Пермь, 2007. – С.236-241.

6. Аналитическое изучение золпидема спектральными методами / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Е.Б. Бабушкина, С.С. Катаев, Н.В. Кокшарова // Человек и лекарство: тез. докл. XV Рос. нац. конгр. Москва, апрель 2008. – М., 2008. - С. 567-568.

7. Хомов, Ю.А. К анализу золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // «Фармация XXI века: достижения, проблемы и пути их решения», 25-26 апреля 2008 г.: материалы … – СПб, 2008. – С. 176-178.

8. Хомов, Ю.А. Количественное определение золпидема в биологических жидкостях с применением метода УФ-спектрофотометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова // Рос. науч.- практ. конф. ПГФА, в рамках 14-ой Междунар. выставки «Медицина и здоровье» (13-15 ноября 2008 г., Пермь): материалы… – Пермь, 2008. – С. 386-389.

10. Егорова, Е.И. Золпидем: возможность зависимости, клиническая лабораторная диагностика / Е.И. Егорова // Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых “ Фармация в XXI веке : эстафета поколений”, посвященная 90-летию СПХФА, 23-24 апреля 2009 г. – СПб, 2009. – С. 61-62.

11. Шилова, Е.А. Количественное определение золпидема в моче методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии / Е.А. Шилова, Е.И. Егорова // Вестник ПГФА. – Пермь. – 2009. – №5. – С. 165-167.

12. Химико-токсикологический анализ золпидема / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова, Е.А. Шилова // Вестник РУДН, серия Медицина. – 2009. № 4. – С.469-473.

13. Прогнозирование оптимальных условий экстракции золпидема из биологических проб / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Н.В. Кокшарова, М. Дайех, М. Алабед // Х Междунар. науч. конгресс “Здоровье и образование в XXI. Инновац. технологии в биологии и медицине”, посвящ. 50-летн. юбилею РУДН; (09-12 декабря 2009 г.): материалы … – М., 2009. – С.155-157.

14. Хомов, Ю.А. Валидация методики ВЭЖХ определения золпидема в биологических жидкостях / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, М. Дайех // Вестник РУДН, серия Медицина. – 2010. - №3. – С. 123-125.

15. Определение золпидема в моче пациентов с использованием методов ВЭТСХ, ВЭЖХ, УФ-, ГХ/МС спектрометрии / Ю.А. Хомов, Е.И. Егорова, Ю.Н. Карпенко, Е.А. Крылова, Л. Мескини // Вестник ПГФА. – Пермь. – 2010. – №7. – С. 272-275.



 
Похожие работы:

«ЛЕБЕДЕВА НАТАЛЬЯ НИКОЛАЕВНА РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСНОГО ПОДХОДА К ОБНАРУЖЕНИЮ ФАЛЬСИФИЦИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ГРУППЫ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ...»

«КАЗАРЦЕВ ИЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВИЧ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНИЛАЛКИЛАМИНА (кетамина, мидокалма, флуоксетина, сиднокарба) 14.04.02. Фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук ПЕРМЬ – 2011 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Алтайский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный руководитель: доктор...»

«Орлов Федор Сергеевич Анализ и стандартизация лекарственной формы с модифицированным высвобождением нового оригинального отечественного препарата дилепт 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздрава РФ. Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессор...»

«КАЛИНИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ КОРОВЯКА ЧЕРНОГО И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения...»

«Полуэктова Татьяна Викторовна РАЗРАБОТКА СОСТАВА И СТ АНДАРТИЗАЦИ Я СБОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО ЭСТРОГЕНОПОДОБНЫМ ДЕЙСТВИЕМ 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2011 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской...»

«Козеев Сергей Геннадьевич РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА АРАНОЗА 14.04.01 - Технология получения лекарств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессор Краснюк Иван Иванович доктор фармацевтических наук, профессор...»

«Поспелова Анна Анатольевна ОБРАЩЕННО-ФАЗНЫЙ ВАРИАНТ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ РЯДА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства...»

«Мирович Вера Михайловна ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДОВ ORIGANUM L. И RHODODENDRON L. ФЛОРЫ ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ 14.04.02 – ф армацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Улан-Удэ - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и...»

«НГУЕН ТХИ НЬЫ КУИНЬ ИЗУЧЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ЭФИРНЫЕ МАСЛА 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва - 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России Научный руководитель : доктор фармацевтических наук, доцент Гравель Ирина Валерьевна Официальные...»

«Валиева Екатерина Марсиловна Разработка подходов к оптимизации обеспечения детей фармацевтическими средствами, содержащими пробиотики 14.04.03 – Организация фармацевтического дела автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2012 Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Казанский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития России Научный руководитель: Доктор фармацевтических наук, профессор Егорова Светлана...»

«ЛИТВИНЕНКО МАРИЯ МАКСИМОВНА ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ЛЕКАРСТВЕННОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ Специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,...»

«Заикин Кирилл Сергеевич МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФИНА И ТРАМАДОЛА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ 14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва - 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия имени И.М.Сеченова Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессор, академик РАМН доктор фармацевтических наук, профессор Арзамасцев Александр Павлович...»

«Зубкова Наталия Васильевна Биотехнологические аспекты вирусной безопасности препаратов и ммуноглобул и нов: мет о долог ия, производство, стандартизация 14.04.01- технология получения лекарств Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Пермь - 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном...»

«ЗИНЧУК ИЛЬЯ ЮРЬЕВИЧ ОПТИМИЗАЦИЯ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ПОМОЩИ БОЛЬНЫМ РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ НА ОСНОВЕ ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель: доктор...»

«СМОЛЬНИКОВА ВАЛЕНТИНА ПЕТРОВНА РАЗРАБОТКА СПОСОБА ПОЛУЧЕНИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЭКСТРАКТА ЖИДКОГО ПРОТИВОДИАБЕТИЧЕСКОГО 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь, 2012 Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Дальневосточный государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Научный руководитель: доктор фармацевтических...»

«ПОНОМАРЕВА АЛЕНА АНАТОЛЬЕВНА ФОРМИРОВАНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО АССОРТИМЕНТА АНТИБИОТИКОВ ДЛЯ СТАЦИОНАРНОГО ЛЕЧЕНИЯ ДЕТЕЙ (НА ПРИМЕРЕ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ) 14.04.03 – организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических нау к Пермь-2012 Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный...»

«РЫЛИНА ЕЛЕНА ВАЛЕРЬЕВНА ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИКАТОРНЫХ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НЕФЛАВОНОИДНОЙ ПРИРОДЫ В ЛЕКАРСТВЕННОМ И ПИЩЕВОМ РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук МОСКВА – 2010 Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова Научные руководители: Академик РАМН, доктор фармацевти- ческих наук,...»

«КАЛИНИН ДМИТРИЙ ВАДИМОВИЧ СИНТЕЗ, ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СОЛЕЙ АРИЛАМИДОВ N- АЛКИЛПИРРОЛИДИН-2-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства...»

«Сулейманова Лилия Ривхатовна ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ ПЕРЦА ОДНОЛЕТНЕГО ( СAPSICUM ANNUUM L.) 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2011 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития...»

«Ростова Наталья Борисовна Обоснование организационно-фармацевтических подх о дов к оптимизации лекарственного обеспечения населения на основе рационально го испо льзовани я лека р ственных средств Специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Пермь 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная...»








 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.