WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Методы исследования морфина и трамадола в судебно-химическом анализе

На правах рукописи

Заикин Кирилл Сергеевич

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МОРФИНА И ТРАМАДОЛА В СУДЕБНО-ХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

А в т о р е ф е р а т

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия

имени И.М.Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, профессор, академик РАМН

доктор фармацевтических наук, профессор

Арзамасцев Александр Павлович

Раменская Галина Владиславовна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, Белобородов Владимир Леонидович

профессор

Кандидат фармацевтических наук Герникова Евгения Петровна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное Учреждение « Российский центр судебно-медицинской экспертизы Росздрава »

Защита состоится « 24 » мая 2010 г. в 14.00 часов на заседании Диссер-
тационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии имени
И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Биб­лиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

В настоящее время препараты из группы агонистов опиоидных рецепторов, такие как морфин и трамадол, широко применяются как лекарственные средства. Их применение с немедицинскими целями, а также применение героина, одним из метаболитов которого является морфин, распространено у людей с наркотической зависимостью [Galichet, 2004; Веселовская, 2002]. Часто эти вещества являются причиной передозировок и летальных исходов [Baselt, 1995; Веселовская, 2000].

По отчётным данным 2009 года Государственного Учреждения Здравоохранения Московской области Бюро Судебно-Медицинской Экспертизы Министерства Здравоохранения Московской Области (ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО) второе место по результатам исследований биоматериала от живых лиц занимают наркотические вещества, из них подавляющее количество составляют опиаты (3627 положительных из 12539 случаев). По результатам исследования аутопсийного материала наркотические вещества занимают третье место. Среди наркотических веществ преобладают опиаты (1068 положительных из 8037 случаев).

В судебно-химическом анализе для определения агонистов опиоидных рецепторов применяются: высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [Matthew H. Slawson, 2007]; газожидкостная хроматография (ГЖХ) [Изотов, 2000]; иммунные методы [Sam Niedbala, 2001]. В настоящее время развитие газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) делает этот метод наиболее предпочтительным и перспективным. Метод обладает высокой селективностью, а требуемый предел количественного определения (0,01 мг/л) может быть достигнут при изменении условий хроматографирования.

В связи с тем, что в отечественной литературе отсутствуют валидированные методики определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, учитывающие последние разработки в этой области, актуальной задачей является разработка метода количественного определения морфина и трамадола, который позволит определять эти вещества в крови на уровне терапевтических концентраций.

Сложность в анализе этих препаратов в крови в рамках химико-токсикологических и судебно-химических исследований обусловлена их низкой дозировкой, низкой терапевтической концентрацией, а также сложной биологической матрицей.

Всё вышеизложенное определило цели и задачи исследования.

Цель исследования.

Разработка высокочувствительной, воспроизводимой методики количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором, и апробирование данной методики в практике судебно-химических исследований.

Задачи исследования.

  1. Изучить влияние различных экстрагентов на эффективность экстракции морфина и трамадола.
  2. Изучить влияние реакции среды на выход морфина и трамадола.
  3. Разработать методику извлечения с учётом изученных параметров.
  4. Изучить влияние ферментативного гидролиза на выход морфина и трамадола.
  5. Изучить хроматографические свойства морфина и трамадола, на основе которых подобрать оптимальные условия хроматографирования.
  6. Разработать методику количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.
  7. Провести валидацию метода количественного определения морфина и трамадола.
  8. Апробация разработанной методики в судебно-химическом отделении при проведении химико-токсикологического анализа.

Научная новизна.

Впервые была разработана валидированная методика, позволяющая достоверно определять морфин и трамадол в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором на уровне предела определения - 0,01 мг/л.

Практическое применение.

По результатам серии экспериментов было показано, что проведение ферментативного гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia значительно увеличивает выход морфина и трамадола при анализе исследуемых биообъектов. Для создания pH среды может быть рекомендовано использование трис-буфера, так как это позволяет добиться максимального выхода морфина и трамадола и получать наиболее стабильные результаты исследований. Разработанная методика определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором позволяют определять данные вещества на уровне предела определения.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Хроматографическое поведение морфина и трамадола под влиянием различных факторов (экстрагент, рН среды, ферментативный гидролиз).
  2. Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.
  3. Апробация данной методики в практике судебно-химического и химико-токсикологического анализа.

Внедрение результатов в практику.

Разработанная методика количественного определения морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором может использоваться при проведении судебно-химического и химико-токсикологического анализа. Данная методика внедрена и применяется в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при проведении исследований аутопсийной крови и сыворотки крови живых лиц.

Апробация работы.

Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова 19 января 2010 года.

Основные теоретические положения и практические результаты работы доложены на XIII конгрессе молодых ученых и специалистов «Наука о человеке» (Томск, 2007 г.), IX итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (Москва 2007г.).

Связь задач исследования с проблемным планом.

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352).

Публикации.

По результатам диссертационного исследования опубликовано 4 печатные работы, в том числе две статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Разработка методики количественного определения морфина и трамадола в крови», выводов и списка литературы из 112 источников (94 из ко­торых зарубежные). Работа иллюстрирована 21 рисунком и 22 таблицами.

Результаты экспериментов обработаны статистически, обобщены в табли­цах, проиллюстрированы рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть исследования проводилась на базе судебно-химического отделения ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО (заведующая - Крупина Наталья Анатольевна).

При определении морфина и трамадола

газохроматографическим методом в качестве объекта исследования использовалась кровь или сыворотка крови живых лиц и кровь аутопсийного материала. В Бюро СМЭ объекты поступали по направлениям врачей судебно-медицинских экспертов судебно-медицинских отделений Бюро и врачей лечебно-профилактических учреждений (больницы, наркологические диспансеры).

Пробу отбирали в помещениях, приспособленных для сбора, упаковки, нанесения информации на контейнер. Кровь для проведения постмортальных судебно-химических исследований отбирали из периферических венозных сосудов (бедренной, плечевой вен), так как она свободна от постлетальной диффузии.

Кровь для проведения исследований на состояние опьянения наркотическими средствами отбирали из локтевых вен. Контейнер с кровью в период доставки перед проведением анализа хранили в вертикальном положении при температуре 0 - 7°С в течении 1-7 дней. После проведения исследования образец крови хранили в морозильнике при температуре -18°С.

Образцы крови отбирали в объеме 10 мл.

Для пробоподготовки и хроматографического анализа применялись следующие реактивы: -глюкуронидаза Helix pomatia НР-2 131700 ед./мл; хч: хлористый метилен; аммиак 25% раствор; сульфат натрия безводный; уксуснокислый натрий CH3COONa* 3H2O;трис(гидроксиметил)аминометан;БСТФА+1%ТМХС(бистриметилсилилтрифторацетамид) + 1 % триметилхлорсилана FLUKA; концентрированная уксусная кислота; изо-бутиловый спирт; вода дистиллированная.

Приборы: хроматограф Agilent Technologies 6890 N Network GC System; масс-селективный детектор Agilent Technologies 5973 N Network; инжектор фирмы Agilent Technologies 7683 Series; автосемплер Agilent Technologies 7683; термостат фирмы Binder серии FD (диапазон температур +50С - +3000С); встряхиватель IKA HS501 (300 колеб./мин); минишейкер IKA MS1. Колонка капиллярная Agilent 19091S-101 HP-5MS 0.20мм*12м*0,33мкм.

Условия ГХ-МС анализа.

Сканирование проводили в режиме селективного мониторинга индивидуальных ионов (с 6,0 мин по 6,9 мин: 335, 320, 245,216; с 8,05 по 8,4 мин: 429, 414, 401; с 8,4 по 8,65 мин: 399, 340, 287; с 11,0 по 18,3 мин: 450, 482, 506, 539).

Начальная температура колонки - 700С. Время выдержки при начальной температуре - 1 минута. Подъем температуры в диапазоне 70-2800С - 200С/мин. Время выдержки при 2800С-15 мин. Скорость газа носителя (гелий)-1,0 мл/мин. Температуры инжектора, масс-селективного источника и интерфейса -2800С, 2900С и 1800С соответственно. Режим – без сброса (splitless). Объем вводимой пробы - 1 мкл. Программное обеспечение: ChemStation software (Rev.A.10.01 ).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор оптимальных условий жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) морфина и трамадола. Выбор экстрагента.

В качестве экстрагентов для морфина и трамадола при проведении ЖЖЭ из крови были изучены смеси для экстракции опиатов из биожидкостей:

хлористый метилен – изобутанол (9:1);

н-гексан – хлористый метилен – изопропанол (60:40:2).

Для оценки эффективности экстракции морфина и трамадола различными растворителями при проведении ЖЖЭ использовали тестовые контрольные образцы сывороток, содержащие 0,4 мг/л морфина и 0,5 мг/л трамадола. При сравнении результатов серии исследований, полученных методом ГХ-МС было выявлено, что эффективность экстракции в образцах, с использованием смеси хлористый метилен – изобутанол (9:1) приблизительно в 3 раза выше, чем при использовании смеси н-гексан – хлористый метилен – изопропанол (60:40:2). Результаты представлены на рисунках 1 и 2.

Рисунок 1. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

Рисунок 2. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л с использованием различных экстрагентов (среднее значение 10 измерений).

Выбор реакции среды.

Учитывая литературные данные о pКа морфина и трамадола, для оптимизации процедуры экстракции было изучено использование трис(гидроксиметил)аминометана (трис-буфера) (1М) и концентрированного раствора аммиака (25%). Перед нами стояла задача создания оптимального значения pH среды 8,5 – 9,0 для последующего использования процедуры ЖЖЭ смесью хлористый метилен – изобутанол (9:1).

Наиболее высокие и стабильные результаты для создания необходимого pH были получены при использовании трис-буфера. Результаты представлены на рисунках 3 и 4.

Рисунок 3. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией морфина 0,4 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания pH (среднее значение 10 измерений).

Рисунок 4. Сравнение результатов исследований тестовых проб сыворотки с концентрацией трамадола 0,5 мг/л после пробоподготовки с использованием аммиака (25% концентрированный раствор) или трис-буфера для создания pH (среднее значение 10 измерений).

Выбор внутреннего стандарта.

Количественное определение морфина и трамадола в крови осуществляли методом градуировочного графика с использованием внутреннего стандарта. Для использования в качестве внутреннего стандарта нами был выбран бупренорфин.

Преимуществом использования бупренорфина как внутреннего стандарта являются его хроматографические свойства, условия экстракции и дериватизации, подобные таковым у определяемых веществ, стабильность полученных результатов, и его доступность для закупки на территории РФ. В зарубежных литературных данных в качестве внутреннего стандарта используют дейтерированные аналоги исследуемых веществ. В связи с дороговизной и невозможностью закупки дейтерированных аналогов нами был выбран бупренорфин.

2. Количественное определение морфина и трамадола в крови методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором.

В таблице 1 представлены хромато-масс-спектрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина.

Таблица 1

Хромато-масс-спектрометрические характеристики ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина

Соединение Время удерживания, мин m/z
Базовый (100%)
Морфин 2ТМС 8,1 73 42919 41410 4017 23621
Трамадол ТМС 6,4 58 3354 3201 2253 7317
Бупренорфин ТМС 12,7 450 48230 50617 5394 5549

Стандартные и калибровочные растворы.

Для калибровки готовили стандартные (1 мг/мл) растворы морфина (Ам), трамадола (Ат), бупренорфина (Аб) (внутренний стандарт) весовым методом из стандартных веществ: морфин гидрохлорида, трамадола и бупренорфин гидрохлорида.

Образцы плазмы для построения калибровочных графиков и контролей отрицательных результатов получены в центре переливания крови.

Рабочий раствор бупренорфина (внутренний стандарт) с концентрацией 0,04 мг/мл готовили из стандартного раствора бупренорфина (1 мл раствора Аб помещали в градуированную колбу вместимостью 25 мл и доводили до 25 мл метанолом). Хранили в морозильной камере (-400С, в течение 3 месяцев).

Калибровочные растворы, содержащие бупренорфин, используемый в качестве внутреннего стандарта, в концентрации 0,8 мг/л крови и морфин в концентрациях: 0,02 мг/л, 0,04 мг/л, 0,2 мг/л, 0,4 мг/л, 2 мг/л, 4 мг/л крови (растворы I-VI соответственно) готовили из растворов морфина с концентрацией 0,2 мг/мл, 0,1 мг/мл, 0,02 мг/мл, 0,01 мг/мл и из раствора бупренорфина с концентрацией 0,4 мг/мл.

При проведении процедуры калибровки к 1 мл сыворотки добавляли по 20 мкл калибровочных растворов (I-VI).

Калибровочные растворы, содержащие бупренорфин, используемый в качестве внутреннего стандарта в концентрации 0,8 мг/л крови и трамадол в концентрациях 0,02 мг/л, 0,05 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л крови (растворы I-VI соответственно) готовили из раствора трамадола с концентрацией 1,0 мг/мл (раствор Ат) и из раствора бупренорфина с концентрацией 1,0 мг/мл.

Приготовленные растворы хранили в морозильной камере (-400С, в течение 3 месяцев).

При проведении процедуры калибровки к 1 мл сыворотки добавляли по 50 мкл калибровочных растворов (I-VI).

Пробоподготовка.

1 мл крови вносили в пробирку (15 мл), добавляли 1мл ацетатного буфера рН 4,8 и 25 мкл -глюкуронидазы Helix Pomatia, герметично закрывали и выдерживали в течение 18 ч при 37°С. К гидролизату добавляли 20 мкл раствора бупренорфина (внутренний стандарт) 0,04 мг/мл, встряхивали на шейкере IKA MS1 10 сек и добавляли 0,3 мл трис-буфера (1М). Образец экстрагировали 4 мл смеси хлористый метилен - изобутанол (9:1) интенсивно встряхивая 10 минут на шейкере IKA HS501 (300 колеб./мин). Центрифугировали 5 минут при 4000об/мин. 3 мл органической фазы переносили в виалу. Экстракт упаривали под током азота в концентраторе экстрактов. Во флакон с сухим остатком с помощью шприца вносили 100 мкл реактива бис(триметилсилил)трифторацетамид (БСТФА) + 1% триметилхлорсилана (ТМС), флакон герметично закрывали, тщательно встряхивали, нагревали в термостате 20 минут при 50°С и проводили исследование методом хромато-масс-спектрометрии.

Параллельно, при вышеуказанных условиях проводили:

- экстракцию крови, не содержащей морфина, трамадола и бупренорфина;

- контрольных проб, содержащих морфин и трамадол в концентрациях в пределах от 0,02 до 4 мг/л и от 0,02 до 2 мг/л соответственно.

Нами было изучено влияние ферментативного гидролиза с использованием -глюкуронидазы Helix Pomatia. Исследование проводили с реальным образцом крови. В результате анализа данного образца по вышеописанной методике были найдены морфин (в концентрации 1,22 мг/л) и трамадол (в концентрации 0,97 мг/л). В последующем данный образец исследовали 10 раз: в 5 случаях пробоподготовка проходила без проведения ферментативного гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia и в 5 случаях согласно приведённой методике. % выхода для морфина без проведения гидролиза составил 21 %, а для трамадола 77 % (данные количественного определения представлены на рисунках 5 и 6).

Рисунок 5. Сравнение результатов количественного определения крови на наличие морфина с проведением гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia и без него.

Рисунок 6. Сравнение результатов количественного определения крови на наличие трамадола с проведением гидролиза -глюкуронидазой Helix Pomatia и без него.

Таким образом, проведение ферментативного гидролиза крови более чем в 5 раз увеличивает выход морфина и в 1,5 раза увеличивает выход трамадола.

Валидация метода.

Валидацию метода осуществляли по показателям: линейность, аналитическая область методики, предел количественного определения, специфичность, правильность, прецизионность.

Контроль «отрицательный» - извлечение из бланковой сыворотки (контрольная хроматограмма образца, не содержащего морфина, трамадола и бупренорфина).

Нами была проведена статистическая обработка.

Для определения линейности и аналитической области калибровочные графики (рисунки 7 и 8) были построены по 6 калибровочным точкам (по 5 каждой концентрации). Калибровочные образцы содержали следующие концентрации морфина: 0,02 мг/л, 0,04 мг/л, 0,2 мг/л, 0,4 мг/л, 2 мг/л, 4 мг/л сыворотки крови, и трамадол в концентрациях 0,02 мг/л, 0,05 мг/л, 0,1 мг/л, 0,5мг/л, 1 мг/л, 2 мг/л сыворотки крови. Для построения графика и определения концентрации морфина и трамадола в крови использовался метод линейного регрессионного анализа ChemStation на основании отношения высот пиков молекулярных ионов морфин 2 ТМС производного (429) к базовому иону бупренорфин ТМС производного (450) и трамадол ТМС производного (335) к базовому иону бупренорфин ТМС производного (450). Коэффициент корреляции: для морфина - 0,999, для трамадола – 0,993. Свободный член линейного уравнения: для морфина - 0,0351, для трамадола – 0,0292. Наклон регрессионной прямой: для морфина - 0,4425, для трамадола – 0,2126.

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков морфина и трамадола к концентрациям и пикам бупренорфина приведены в таблицах 2 и 3 соответственно.

Таблица 2

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков морфина к концентрациям и пикам бупренорфина

Концен­трация морфина, мг/мл Концен­трация бу­пренор­фина, мг/мл Отношение концентра­ций Интенсив­ность пика иона мор­фина (429) Интенсивность пика иона бу­пренорфина (450) Отношение интенсивностей
0,02 0,8 0,0250 1065 47334 0,0224
0,04 0,8 0,0500 1857 50488 0,0367
0,2 0,8 0,2500 6720 45394 0,1480
0,4 0,8 0,5000 14838 52739 0,2813
2,0 0,8 2,5000 57204 48480 1,1799
4,0 0,8 5,0000 103897 46673 2,2260

Таблица 3

Значения отношений концентраций и интенсивностей пиков трамадола к концентрациям и пикам бупренорфина

Концен­трация трамадола, мг/мл Концен­трация бу­пренор­фина, мг/мл Отношение концентра­ций Интенсив­ность пика иона трамадола (335) Интенсивность пика иона бу­пренорфина (450) Отношение интенсивностей
0,02 0,8 0,0250 1240 89949 0,0137
0,05 0,8 0,0625 2149 80160 0,0268
0,1 0,8 0,1250 4843 89365 0,0541
0,5 0,8 0,6250 16975 87499 0,1940
1,0 0,8 1,2500 27477 85182 0,3225
2,0 0,8 2,5000 45855 84942 0,5398

Resp Ratio=4,52е-001*Amt; Coef of det (r2)=0.999; Curve fit: Linear/(0,0)

Рисунок 7. Калибровочный график, построенный на ГХ-МС для морфина.

Resp Ratio=2,18е-001*Amt; Coef of det (r2)=0.993; Curve fit: Linear/(0,0)

Рисунок 8. Калибровочный график, построенный на ГХ-МС для трамадола.

Для определения концентрации морфина и трамадола использовали метод обработки MM_DD_YY_M.

Пределы обнаружения и определения морфина и трамадола (таблица 4) были рассчитаны для молекулярных ионов 429 (для морфин 2 ТМС) и 335 (для трамадол ТМС) при соблюдении соотношения сигнал/шум 1:3 и 1:10 соответственно.

Выход морфина и трамадола (таблица 4) был оценен следующим образом: была произведена процедура пробоподготовки с добавлением внутреннего стандарта 4-х образцов бланковой сыворотки, содержащей морфин в концентрации 0,2 мг/л, трамадол в концентрации 0,1 мг/л 4-х образцов бланковой сыворотки, содержащей морфин в концентрациях 0,4 мг/л, а трамадол в концентрации 0,5 мг/л и 4-х образцов бланковой сыворотки, не содержащей морфин, трамадол и бупренорфин.

К сухим остаткам извлечений из 2-х образцов сыворотки, не содержащей морфин и трамадол, добавляли по 20 мкл калибровочного раствора морфина (III) (концентрация морфина 0,2 мг/л крови) и по 50 мкл калибровочного раствора (III) (концентрация трамадола 0,1 мг/л крови). К сухим остаткам извлечений из 2-х образцов сыворотки, не содержащей морфин и трамадол, добавляли по 20 мкл калибровочного раствора морфина (IV) (концентрация морфина 0,4 мг/л крови) и 50 мкл калибровочного раствора (IV) (концентрация трамадола 0,5 мг/л крови).

Содержимое всех виал выпаривали досуха. К полученным сухим остаткам добавляли 100 мкл реактива БСТФА +1%ТМХС (силилирующий реагент), флакон герметично закрывали, тщательно встряхивали, нагревали в термостате 20 минут при 50°С и проводили исследование методом хромато-масс-спектрометрии.

В таблице 4 представлены процентный выход, пределы обнаружения и определения морфина и трамадола.

Таблица 4

Процентный выход, пределы обнаружения и определения морфина и трамадола

Вещество Выход, % Предел обнаружения, мг/л Предел определения, мг/л
морфин 78 0,005 0,01
трамадол 86 0,005 0,01

Оценка специфичности: в исследуемых пробах (калибровочные образцы крови и исследуемые образцы) идентифицировали хроматографические пики по времени удерживания и масс-спектрам, совпадающие с хроматографическими пиками морфин 2 ТМС производного и трамадол ТМС производного стандартных растворов.

Перед анализом проб проверили отсутствие на хроматограмме бланковой крови пиков, соответствующих морфину в виде морфин 2ТМС производного, трамадолу в виде трамадол ТМС производного, бупренорфину в виде бупренорфин ТМС производного.

Оценка правильности методики и ее прецизионность представлены в таблицах 5 и 6.

Таблица 5

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10 измерений) морфина

Хi, мг/мл Средняя концентрация, (мг/мл) Х Стандартное отклонение S Относительное стандартное отклонение RSD (%) Доверительный интервал X при P=0.9 Х ± X
0,0200 0,0220 0,0045 20,4545 0,0056 0,0220± 0,0056
0,0400 0,0420 0,0045 10,7142 0,0056 0,0420± 0,0056
0,2000 0,2080 0,0084 4,0384 0,0104 0,2080± 0,0104
0,4000 0,4140 0,0134 3,2367 0,0167 0,4140± 0,0167
2,0000 2,0400 0,0274 1,3431 0,0340 2,0400± 0,0340
4,0000 4,0600 0,0412 0,3478 0,0512 4,0600± 0,0512

Таблица 6

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10 измерений) трамадола

Хi, мг/мл Средняя концентрация, (мг/мл) Х Стандартное отклонение S Относительное стандартное отклонение RSD (%) Доверительный интервал X при P=0.9 Х ± X
0,0200 0,0240 0,0055 22,9167 0,0068 0,0240± 0,0068
0,0500 0,0520 0,0045 8,6538 0,0056 0,0520± 0,0056
0,1000 0,1060 0,0089 8,3962 0,0111 0,1060± 0,0111
0,5000 0,5140 0,0167 3,2490 0,0208 0,5140± 0,0208
1,0000 1,0280 0,0164 1,5953 0,0204 1,0280± 0,0204
2,0000 2,0360 0,0241 1,1836 0,0299 2,0360± 0,0299

Статистические данные результатов исследований представлены в таблице 7.

Таблица 7

Статистическая обработка результатов исследований определения (результат 10 измерений) морфина и трамадола

Хi, мг/мл Морфин Хi, мг/мл Трамадол
Дисперсия Ошибка Дисперсия Ошибка
0,0200 0 25,2284 0,0200 0 28,3235
0,0400 0 13,2149 0,0500 0 10,6735
0,2000 0,0001 4,9921 0,1000 0,0001 10,4722
0,4000 0,0002 4,0219 0,5000 0,0003 4,0403
2,0000 0,0008 1,6661 1,0000 0,0003 1,9837
4,0000 0,0017 1,2604 2,0000 0,0006 1,4680

В исследуемых пробах необходимо было идентифицировать пик по времени удерживания и масс спектру, совпадающий с временем удерживания пика морфин 2 ТМС производного и пик по времени удерживания и масс спектру, совпадающий с временем удерживания пика трамадол ТМС производного, пик по времени удерживания, совпадающий с временем удерживания пика бупренорфин ТМС производного.

В контрольной пробе - идентифицировали пик по времени удерживания и масс-спектру, совпадающий с временем удерживания и масс-спектром пика морфин 2 ТМС производного и пик по времени удерживания и масс-спектру, совпадающий с временем удерживания и масс-спектром пика трамадол ТМС производного (рисунки 9-17). Концентрация морфина и трамадола в контрольных пробах должна быть в пределах 8% истинного значения для морфина и 9% истинного значения для трамадола. Если величина концентрации находится за этим пределом необходимо провести новую калибровку.

Примеры хроматограмм извлечений из образцов крови и масс-спектры ТМС производных морфина, трамадола и бупренорфина, полученные в различных режимах, представлены на рисунках 9-17.

Рисунок 9. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотки, с пиком 2 ТМС производного морфина с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SСАN.

Рисунок 10. Масс-спектр морфин 2 ТМС производного (извлечение из крови и библиотечный) в режиме SCAN.

Рисунок 11. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотки, с пиком ТМС производного трамадола с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SСАN.

Рисунок 12. Масс-спектр трамадол ТМС производного (извлечение из крови и библиотечный) в режиме SCAN.

Рисунок 13. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотки с пиком 2 ТМС производного морфина и ТМС производного бупренорфина с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SIM.

Рисунок 14. Масс-спектр 2 ТМС производного морфина в режиме SIM.

Рисунок 15. Масс-спектр ТМС-производного бупренорфина в режиме SIM.

Рисунок 16. Фрагмент хроматограммы извлечения из образца сыворотки с пиком ТМС производного трамадола с экстракцией по характеристическим ионам в режиме SIM.

Рисунок 17. Масс-спектр ТМС производного трамадола в режиме SIM.

Разработанная методика была апробирована в ГУЗ МО Бюро СМЭ МЗ МО при исследовании образцов аутопсийной крови и крови живых лиц. В результате по разработанной методике морфин был обнаружен в интервале концентраций 0,01-30,0 мг/мл, трамадол – 0,01-9,0 мг/мл.

Были проанализированы 1318 образцов аутопсийной крови, среди них:

- в результате количественного определения (674-х положительных образцов крови на наличие морфина) в 30 % случаев концентрация морфина была летальной, в 50 % - токсической, а в 20% - терапевтической;

- в результате количественного определения (178-х положительных образцов крови на наличие трамадола) в 4 % случаев концентрация трамадола была летальной, в 21 % - токсической, а в 75% - терапевтической.

И 257 образцов сыворотки крови живых лиц, среди них:

- в результате количественного определения (114-ти положительных образцов крови на наличие морфина) в 2 % случаев концентрация морфина была летальной, в 55 % - токсической, а в 43% - терапевтической;

- в результате количественного определения (54-х положительных образцов крови на наличие трамадола) в 0 % случаев концентрация трамадола была летальной, в 7 % - токсической, а в 93% - терапевтической.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

  1. Использование смеси хлористый метилен – изобутанол (9:1) для проведения процедуры жидкость-жидкостной экстракции позволяет получить высокие и стабильные значения интенсивностей хроматографических пиков молекулярных ионов силильных производных морфина и трамадола.
  2. Использование трис-буфера для создания pH среды при проведении жидкость-жидкостной экстракции позволяет получить высокие и стабильные значения интенсивностей хроматографических пиков молекулярных ионов силильных производных морфина и трамадола.
  3. Использование силилирования в качестве дериватизирующей процедуры увеличивает чувствительность газохроматографического определения и позволяет детектировать низкие концентрации морфина и трамадола в крови.
  4. При проведении процедуры жидкость-жидкостной экстракции, использование ферментативного гидролиза, значительно увеличивает выход морфина и трамадола.
  5. В качестве внутреннего стандарта был выбран бупренорфин вследствие его хороших хроматографических свойств, одинаковых условий экстракции и дериватизации, стабильности полученных результатов, схожести в химических структурах, возможности проведения анализа в тех же условиях и доступности его для закупки на территории РФ.
  6. Разработана методика количественного определения морфина и трамадола методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором (ГХ-МС) в крови с использованием процедуры жидкость-жидкостной экстракции.
  7. Разработанная методика обладает необходимой правильностью, прецизионностью, специфичностью, линейностью. Предел количественного определения для морфина и трамадола составляет 0,010 мг/л.
  8. Предложенная методика количественного определения морфина и трамадола методом газовой хроматографии с масс-селективным детектором была применена в судебно-химическом отделе ГУЗ МО Бюро судебно-медицинской экспертизы при проведении химико-токсикологических исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Заикин К.С. Количественный анализ морфина и некоторых его аналогов в крови //Материалы итоговой научной студенческой конференции с международным участием «Татьянин день», посвященной 250-летию Московской медицинской академии им.И.М. Сеченова. – Москва ФГОУ «ВУНМЦ Росздрава», 2007. – С. 5-6.
  2. Заикин К.С. Количественный анализ морфина и некоторых его аналогов в крови. //Материалы VIII конгресса «Науки о человеке» молодых ученых и специалистов. – Томск, 2007. - С. 227-228.
  3. Заикин К.С., Крупина Н.А. Определение морфина в крови. Обзор данных ГУ Бюро Судебно-медицинской экспертизы Министерства Здравоохранения московской области //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. Научно-практический журнал. – Москва, 2008. - №6. – С. 24-26.
  4. Заикин К.С., Раменская Г.В., Арзамасцев А.П. Фармакокинетика, фармакодинамика и анализ морфина и трамадола //Химико-фармацевтический журнал. - Москва, 2010. - Т. 44. - №2. - С. 3-7.


 
Похожие работы:

«Автина Татьяна Валерьевна РАЗРАБОТКА ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С ФЛУКОНАЗОЛОМ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КАНДИДОЗОВ 14.04.01 – технология получения лекарств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Курский государственный медицинский университет Минздрава России Научные руководители: доктор фармацевтических наук, профессор Панкрушева...»

«джупарова ирина алексеевна Теоретические и методические основы построения фармакогеографической модели модернизации системы управления лекарственным обеспечением больных социально значимыми заболеваниями на региональном уровне 14.04.03 – Организация фармацевтического дела автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«ГОНЧАРОВ ЖАНИК ВАЛЕРЬЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДЕТЕРМИНАНТ УСПЕХА И НЕУДАЧИ В ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ РОЗНИЧНОЙ СЕТИ НА МУНИЦИПАЛЬНОМ УРОВНЕ Специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Работа выполнена в Пятигорском филиале Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Волгоградский государственный...»

«Ростова Наталья Борисовна Обоснование организационно-фармацевтических подх о дов к оптимизации лекарственного обеспечения населения на основе рационально го испо льзовани я лека р ственных средств Специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Пермь 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная...»

«КОРЕНСКАЯ ИРИНА МИХАЙЛОВНА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ СЕМЯН РАЗЛИЧНЫХ СОРТОВ АМАРАНТА ПЕЧАЛЬНОГО ( AMARANTHUS HYPOCHONDRIACUS L.) Специальность 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Воронежский государственный университет Министерства образования и...»

«Собин Фёдор Владимирович СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ ХИМИЧЕСКИХ ПРЕВРАЩЕНИЙ n -ГЕТЕРИЛАМИДОВ 4 -АРИЛ-2-ГИДРОКСИ-4-ОКСО-2-БУТЕНОВЫХ КИСЛОТ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2011 Работа выполнена в ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному...»

«Буланкин Денис Георгиевич ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ И РАЗРАБОТКЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ НА ОСНОВЕ ЛИСТЬЕВ ГИНКГО ДВУЛОПАСТНОГО ( GINKGO BILOBA L.) 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2011 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Министерства...»

«КАЛИНИНА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ КОРОВЯКА ЧЕРНОГО И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНЕ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 Диссертационная работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермская государственная фармацевтическая академия Министерства здравоохранения...»

«Жданова Алина Валитовна ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНЫХ КОМПОНЕНТОВ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ НИЗКОМИНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИЛОВЫХ СУЛЬФИДНЫХ ГРЯЗЕЙ КАК ИСТОЧНИКА АНТИОКСИДАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Самара – 2011 Диссертационная работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Самарский...»

«Дзанаева Алана Викторовна МЕТОДИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ОЦЕНКЕ ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИКОАГУЛЯНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ 14.04.03 - Организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Диссертационная работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: МАКСИМКИНА ЕЛЕНА...»

«ДУДАРЕНКОВА Марина Рудольфовна РАЗРАБОТКА ОРГАНИЗАЦИОННО-ЭКОНОМИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ К АПТЕЧНОМУ ИЗГОТОВЛЕНИЮ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ТЕРРИТОРИАЛЬНОМ УРОВНЕ (НА ПРИМЕРЕ ОРЕНБУРГСКОЙ ОБЛАСТИ) 14.04.03 организация фармацевтического дела Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук, доцент ГЛАДУНОВА Елена Павловна Пермь - 2011 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Самарский государственный...»

«ПЕГОВА МАРИНА АЛЕКСАНДРОВНА ОЦЕНКА РАЦИОНАЛЬНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В ЛЕЧЕНИИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ В УСЛОВИЯХ СТАЦИОНАРА (на примере Нижегородской области) 14.04.03 - организация фармацевтического дела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук...»

«Дворникова Любовь Габдулбариевна ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КУКУРУЗЫ СТОЛБИКОВ С РЫЛЬЦАМИ И СОЗДАНИЕ НА ИХ ОСНОВЕ ПРЕПАРАТОВ ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ 14.04.01 – технология получения лекарств 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Алтайский государственный...»

«Григорян Людмила Георгиевна Разработка технологии и стандартизация дозированных порошков синбиотиков на основе би фидобактерий Специальность 14.04.01 – технология получения лекарств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук Пермь – 2013 Работа выполнена на кафедре промышленной технологии лекарств с курсом биотехнологии ГБОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздрава РФ Научный руководитель: Научный консультант:...»

«Краснюк Иван Иванович Повышение биодоступности лекарственных форм с применением твердых дисперсий 14.04.01 – технология получения лекарств, 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук Москва – 2010 г. Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова. Научные консультанты: доктор фармацевтических наук, доктор медицинских наук, профессор Хабриев Рамил Усманович...»

«ГОРИНА ЯНА ВАЛЕРЬЕВНА ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ РОДА STELLARIA И ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ 14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук ПЕРМЬ – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и...»

«НГУЕН ТХИ НЬЫ КУИНЬ ИЗУЧЕНИЕ МИНЕРАЛЬНОГО СОСТАВА ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ, СОДЕРЖАЩЕГО ЭФИРНЫЕ МАСЛА 14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва - 2013 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России Научный руководитель : доктор фармацевтических наук, доцент Гравель Ирина Валерьевна Официальные...»

«Тихонова Наталья Викторовна РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ДИЛЕПТА 14.04.01 – технология получения лекарств АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва – 2013 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова Российской академии медицинских наук (ФГБУ НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН) Научный...»

«Нестерова Дилфия Фатыховна НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ОПТИМИЗАЦИИ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ АПТЕКИ МЕДИЦИНСКОЙ ОРГАНИЗАЦИИ (НА УРОВНЕ СТАЦИОНАРНОЙ ПОМОЩИ) специальность 14.04.03 – организация фармацевтического дела АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва - 2013 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Башкирский государственный медицинский университет Министерства...»

«Раева Анастасия Анатольевна ИЗУЧЕНИЕ МЕТАБОЛОМА ЛИСТЬЕВ БЕРЕЗЫ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА 14.04.01 – Технология получения лекарств Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Москва 2010 Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН. Научный руководитель: Доктор фармацевтических наук, профессор Демина Наталья Борисовна Официальные...»








 
2014 www.avtoreferat.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.